Beschleunigte Rekonstruktion des Schädelknochendefekts der Ratte mithilfe von 3D

May 20, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12145 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Selbstheilung und autologe Knochentransplantation von Schädeldefekten kann eine Herausforderung darstellen. Daher ist die Herstellung von Gerüsten für deren schnelle und effektive Reparatur ein vielversprechendes Forschungsgebiet. Dieses Papier lieferte eine vergleichende Studie über die Fähigkeit von dreidimensionalen (3D) gedruckten Gerüsten aus Polycaprolacton (PCL) und PCL-modifizierten Biokeramikgerüsten aus Hydroxylapatit (HA) und Bioglas (BG) in neu gebildetem Knochen im Bereich des Schädeldachdefekts. Die untersuchten 3D-gedruckten PCL-Gerüste wurden durch schichtweise Modellierung durch Schmelzabscheidung hergestellt. Nach der Bewertung der Zelladhäsion auf der Oberfläche der Gerüste wurden diese in ein Ratten-Kalvariendefektmodell implantiert. Die Ratten wurden in vier Gruppen mit Gerüsttransplantaten einschließlich PCL, PCL/HA, PCL/BG und PCL/HA/BG sowie einer Kontrollgruppe ohne Explantat eingeteilt. Die Kapazität der 3D-gedruckten Gerüste bei der Knochenregeneration der Schädeldecke wurde mithilfe von Mikro-Computertomographie-Scans sowie histologischen und immunhistochemischen Analysen untersucht. Schließlich wurden auch die Expressionsniveaus mehrerer knochenbezogener Gene sowie die Expression von miR-20a und miR-17-5p als positive Regulatoren und miR-125a als negativer Regulator in Osteogenesewegen untersucht. Die Ergebnisse dieser Vergleichsstudie haben gezeigt, dass PCL-Gerüste mit HA- und BG-Biokeramik ein großes Anwendungsspektrum im Bereich der Behandlung von Schädeldachdefekten haben.

Die häufigste Art von Verletzung sind Knochenbrüche, die durch Alterung, Stoffwechselstörungen, Unfälle oder Traumata verursacht werden können1. Knochen hat die Fähigkeit, sich bei kleinen Verletzungen selbst zu regenerieren und zu reparieren2,3. Große Knochenbrüche erfordern jedoch eine Transplantation, was eine erhebliche klinische Herausforderung darstellt4. Ein alternativer Ansatz ist die Knochenregeneration durch Matriximplantation in den betroffenen Bereich5. Eine weitere geeignete Methode zur Behandlung von Knochenbrüchen, Osteoporose und Knochenanomalien ist das Bone Tissue Engineering, das technische Materialien, biomedizinische Technologie und erneuerbare Stammzellen kombiniert6. Konstruierte Gerüste beeinflussen den Massentransport erheblich und unterstützen die Zellproliferation, -adhäsion und -wachstum7. Kontrollierte biologische Abbaubarkeit, geeignete mechanische Festigkeit und eine vernetzte Porenstruktur mit der gewünschten Porengröße und Porosität für das Zellwachstum sind die Merkmale eines idealen Gerüsts8,9. Ein geeignetes Knochengerüst sollte über ein miteinander verbundenes poröses System mit einer Porosität von etwa 65 % und einer Porengröße von etwa 200–800 µm verfügen, um die poröse Struktur eines natürlichen Knochens nachzuahmen10. Es besteht ein großes Interesse an der Entwicklung von Baumethoden zur Erhöhung der Funktionalität von Gerüsten. Die dreidimensionale (3D-)Drucktechnologie ist im Bereich der biomedizinischen Geweberegenerationstechnik weit verbreitet und nutzt CAD-Software (Computer Aided Design), um komplexe 3D-Strukturen zu konstruieren11,12,13. Dank der Fortschritte in der Medizintechnik konnten Chirurgen Schädeldefekte von Patienten mit einem Computertomographie-Scanner (CT) scannen und ein 3D-Gerüstmodell auf der Grundlage digitaler Daten mithilfe von Biomaterialien erstellen, um die Rekonstruktion der Schädeldeformitäten zu unterstützen14,15,16,17,18 . Eine der gebräuchlichsten und kostengünstigsten 3D-Drucktechnologien ist die Fused Deposition Modeling (FDM)-Technik, mit der Gerüste hergestellt werden können, indem die Biomaterialien Schicht für Schicht aus einer temperaturgesteuerten Düse eingespritzt werden17. Ein Beispiel für Biomaterialien ist Poly-ε-Caprolacton (PCL), ein biokompatibles Polymer, das von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen wurde. Aufgrund seiner Oberflächenhydrophobie ist PCL jedoch nicht für die Zellanheftung und -proliferation geeignet19. Daher kann die Verwendung dieses Polymers beim Aufbau von Gerüsten für das Tissue Engineering eingeschränkt sein. Um dieses Problem zu lösen, werden bioaktive Keramiken wie Hydroxylapatit (HA) und bioaktive Gläser (BG), die der Knochenmineralphase ähneln, verwendet, um die Zellbindung von PCL-Gerüsten zu verbessern. Bioaktive Keramikgerüste können aufgrund der Bildung von HA-ähnlichen Knochenschichten zu starken chemischen Bindungen mit dem Knochengewebe führen20. Daher sind bioaktive Keramiken aufgrund ihres hohen Potenzials zur Knochenbindung und ihrer stimulierenden Wirkung auf die Knochenneubildung die am häufigsten verwendeten Materialien im Knochengewebe-Engineering21. HA (Ca5(PO4)3(OH)) ist ein natürlicher mineralischer Bestandteil des Knochens und weist ausgezeichnete Bioaktivität, Biokompatibilität, Bioleitfähigkeit, Nichttoxizität und nicht-entzündliche Eigenschaften auf. Es ist sehr hart, aber zerbrechlich und seine Abbaurate im Körper ist sehr langsam. Aus diesem Grund wird es zusammen mit natürlichen oder synthetischen Polymeren zur Herstellung von Gerüsten verwendet22. HA ist für die Knochenbildung von Vorteil, da es Wachstumsfaktoren wie knochenmorphogenetische Proteine ​​(BMPs) stimuliert23. BG ist eine der vielversprechendsten Biokeramiken mit guter Biokompatibilität in vitro und in vivo. Nach dem Einbringen in eine biologische Flüssigkeit produziert BG bioaktive HA-Schichten, die sich an biologisches Gewebe binden und die Knochenbildung verbessern. Die Nachteile von BG sind seine geringe Festigkeit und Sprödigkeit24. microRNAs (miRNAs) sind eine Klasse endogener, evolutionär konservierter, einzelsträngiger RNAs mit einer Länge von etwa 21–23 Nukleotiden, die als posttranskriptionelle Regulatoren fungieren, indem sie auf 3′-untranslatierte Regionen (UTR) abzielen. von Ziel-mRNAs, um ein breites Spektrum biologischer Prozesse zu koordinieren25. In den letzten Jahren hat der Zusammenhang zwischen miRNAs und der Knochenbildung viel Aufmerksamkeit erregt. Studien haben gezeigt, dass miRNAs eine regulierende Wirkung auf die Differenzierung von Osteoblasten und die Knochenentwicklung haben26.

In dieser Forschung haben wir eine FDM-3D-Drucktechnologie und eine einfache Methode zur Modifikation nach der Herstellung verwendet, um Gerüste vorzubereiten, die die Reparatur von Schädeldecken im Schädeldefektmodell der Ratte effektiv fördern können. Vier Gruppen von Gerüsten, darunter PCL, PCL/HA, PCL/BG und PCL/HA/BG, wurden in vivo-Experimenten verwendet, nachdem die Adhäsion und Proliferation menschlicher, aus Fettgewebe gewonnener mesenchymaler Stammzellen (hADMSCs) auf der Oberfläche der Gerüste sichergestellt wurde.

Die Neuheiten dieses Papiers sind wie folgt:

Diese Forschung hat eine umfassende Vergleichsstudie zur Oberflächenmodifikation von 3D-gedruckten PCL-Gerüsten unter Verwendung von HA- und BG-Biokeramik allein und in Kombination zur Reparatur beschädigter Schädelknochen bei Ratten durchgeführt. Die Rate der Knochenneubildung wurde mittels Mikro-CT-Scan, histologischer Analyse einschließlich Alizarinrot, Hämatoxylin-Eosin (H&E), Masson-Trichrom-Färbung und immunhistochemischen (IHC) Tests bewertet. Darüber hinaus wurde die Expression knochenbezogener Gene auf mRNA-Ebene bewertet.

Die Wirkung der Nanotomographie von 3D-gedruckten PCL-, PCL/HA-, PCL/BG- und PCL/HA/BG-Gerüsten auf die Expression von microRNAs und den Zielgenen, die an der Regeneration des Kalvarienknochens von Ratten beteiligt sind, wurde untersucht.

Bei den im Folgenden beschriebenen Experimenten an lebenden Wirbeltieren und den verwendeten Methoden wurden alle relevanten Richtlinien und Vorschriften, insbesondere die ARRIVE-Richtlinien27, vollständig berücksichtigt und beachtet. Darüber hinaus wurden die experimentellen Methoden vom Iran National Committee for Ethics Biomedical Research (IR.IAU.SRB.REC.1401.344) genehmigt.

PCL (Mn = 80.000) wurde von Sigma-Aldrich, USA, bezogen. HA und BG wurden von NikCeram Razi, Iran, gekauft.

Die porösen 3D-Druckgerüste wurden mit einem 3D-Drucker (Omid Afarinan Mohandesi Ayande, BioFabX2, Iran) und der FDM-Methode mithilfe von Software (Repetier Host V2.1.3, 2011_2018) hergestellt. PCL-Pellets schmelzen in einem Heizzylinder und verlassen eine Düse mit einem Ablagemuster von 0/90°. Kreisförmige vierschichtige Gerüste mit einem Durchmesser von 6 mm und den gleichen Parametern: Düse mit 0,5 mm Durchmesser, einer Schichtdicke von 0,2 mm, einem Abstand von 0,3 mm zwischen den beiden Saiten, einer Temperatur von 110 °C und einer Geschwindigkeit von 2 mm/s wurden für In-vitro- und In-vivo-Tests hergestellt. Um die Hydrophilie der Oberfläche von 3D-gedruckten Gerüsten zu verbessern, wurde eine Plasmabehandlung mit einem Niederfrequenz-Plasmagenerator bei 90 GHz und einem zylindrischen Quarzreaktor (Diener Electronics, Nagold, Deutschland) durchgeführt. Reines Sauerstoffgas wurde bei einem Druck von 0,4 mbar in die Reaktion eingeleitet, gefolgt von der Zündung einer Glimmentladung für 3 Minuten. Es wurde eine 1 %ige (w/v) Lösung von HA, BG und HA/BG (jeweils 1 %) hergestellt und zur besseren Dispersion der Mikropartikel wurden die Lösungen 20 Minuten lang bei 37 °C in ein Ultraschallbad gegeben. Mit Plasma behandelte Gerüste wurden über Nacht in HA-, BG- und HA/BG-Lösungen getaucht, um Mikropartikel auf der Oberfläche der Gerüste zu bedecken. Anschließend wurden sie mit entionisiertem Wasser gewaschen und getrocknet. Vier Gruppen der Gerüste (PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG) wurden durch UV und Ethanol sterilisiert und für mehrere Tests verwendet.

Um die Oberflächenmorphologie von PCL-, PCL/HA-, PCL/BG- und PCL/HA/BG-Gerüsten zu charakterisieren, wurde ein Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FeSEM, Mira3, Tescan, Tschechische Republik) verwendet, um die Proben gemäß unserer zuvor berichteten Methode20 abzubilden .

Um die Fähigkeit von 3D-gedruckten Gerüsten zur Zelladhäsion zu bewerten, wurden 104 Zellen/cm2 hAMSCs auf den Gerüsten und TCPs (Gewebekultur-Polystyrol) als Kontrolle ausgesät. Nach 7 bis 14 Tagen Inkubation wurden die besiedelten Gerüste hinsichtlich der Zellanhaftung mit FeSEM (FEI ESEM Quanta 200) gemäß unserer zuvor veröffentlichten Methode untersucht20.

In dieser Studie wurden 10 Wochen alte männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht zwischen 250 und 300 g von der Fakultät für Pharmazie der Universität Teheran (Ethikkommission) verwendet. Die Ratten wurden unter geeigneten Umweltbedingungen hinsichtlich Licht, Temperatur und Ernährung gehalten.

Nach der Operation an Ratten (siehe Hintergrundinformationen 1) wurden die 3D-gedruckten Gerüste im Bereich der Schädeldecke implantiert. Es wurden vier Gruppen untersucht: (1) Ratten mit dem Knochendefekt ohne Implantation (Kontrolle) (2) Ratten mit dem mit PCL-Gerüsten gefüllten Knochendefekt (3) Ratten mit dem mit PCL/HA-Gerüsten gefüllten Knochendefekt (4) Ratten mit dem Mit PCL/BG-Gerüsten gefüllter Knochendefekt (5) Ratten, deren Knochendefekt mit PCL/HA/BG-Gerüsten gefüllt war. Jede Gruppe wurde 30 Tage nach der Operation anästhesiert (mit einer intraperitonealen Injektion von 5 mg/kg Xylazin und 100 mg/kg Ketamin), ihre Köpfe wurden mit einer Guillotine mit einer scharfen Klinge abgeschnitten und die transplantierten Teile wurden abgetrennt. Proben für die histologische Analyse, die IHC, H&E, Masson-Trichrom, Alizarinrot-Färbung und Mikro-CT-Scan umfassten, wurden in 10 % Formalin gelegt und zur Bewertung der Expression von Genen und microRNAs, die an der Knochendifferenzierung beteiligt sind, durch Echtzeit-PCR bei –70 °C platziert Gefrierschrank (Abb. 1e–j).

(a) Die Makroskopie der Morphologie des PCL-Gerüsts und der Nanobiokeramiken auf der Oberfläche. (b) Die Oberflächenmorphologie von PCL/HA, (c) Die Oberflächenmorphologie von PCL/BG und (d) Die Oberflächenmorphologie von PCL/HA/BG-Gerüsten bei 100 KX-Vergrößerungen. (e)–(h) Stadien der Entstehung einer Läsion im Schädeldach von Ratten und der Implantation. (i) Rekonstruktion des Schädeldachdefekts in der Kontrollgruppe nach 30 Tagen. (j) Rekonstruktion des Schädeldachdefekts in Gruppen mit 3D-gedruckten Gerüsttransplantaten nach 30 Tagen.

Die Gewebeproben wurden zunächst in Paraffin eingebettet und dann zur Färbung entparaffiniert (siehe Hintergrundinformationen 1).

Die H&E-Färbung ist eine häufige histologische Färbung, die dazu führt, dass sich der Zellkern blau, Keratin, elastische Fasern und Fibrin leuchtend rot färben. Die Objektträger wurden 7 Sekunden lang in Hämatoxylin (H9627-Sigma) gelegt, und nach dem Waschen wurden sie 2 Sekunden lang in Li2CO3 (1,05680-Sigma) und dann 3 Minuten lang in Eosin (HT110116-Sigma) gelegt. Zur Dehydrierung wurden die Proben jeweils für 4 s in 90 %iges und 100 %iges Ethanol gelegt. Um die Gewebe zu klären, wurden sie abschließend in Xylol gegeben und mit einem optischen Mikroskop beobachtet.

Entparaffinierte Objektträger werden 1 Minute lang in Alizarin (1.06278-Merck) gelegt. Um die überschüssigen Farben zu entfernen, wurden die Objektträger in eine Aceton/Xylol-Lösung (1:1) gelegt, nachdem sie zuvor in 100 % Aceton eingelegt worden waren, und dann mit einem optischen Mikroskop beobachtet.

Zunächst wurden die Objektträger mit abnehmendem Ethanolgehalt dehydriert. Anschließend wurden sie eine Stunde lang in einem Autoklaven bei 56 °C in Boen-Lösung gegeben und anschließend gewaschen. Als nächstes wurde Hämatoxylin-Vagrant-Farbstoff 10 Minuten lang auf das Gewebe gegossen. Anschließend wurden die Proben erneut gewaschen und 10 Minuten lang in eine scharlachrote saure Fuchsinlösung nach Biebrich gegeben. Nach 10-minütigem Waschen wurde eine Phosphorwolfram-Phosphomolybdänsäurelösung auf die Objektträger gegossen. Abschließend wurden sie für 20 Minuten in Anilinblaulösung gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurden die Objektträger in 1 %ige Essigsäure (1,00056-Merck) gelegt und nach Dehydrierung und Verwendung von Xylol beobachtet.

Die Objektträger wurden bis zum Siedepunkt in einer TBS 1X-Lösung (T5912-Sigma) im Mikrowellenofen aufbewahrt und dann mit PBS gewaschen. Triton (T8787-Sigma) 0,3 % wurde 30 Minuten lang verwendet, um die Zellen zu permeabilisieren. Die Objektträger wurden mit PBS gewaschen und dann wurde 10 % Ziegenserum (G9023-Sigma) 45 Minuten lang zu den Proben gegeben. Den Proben wurde Primärantikörper (SC-365797, SC-33645) (1:100 mit PBS) zugesetzt und 24 Stunden lang gekühlt. Die Proben wurden mehrmals mit PBS gewaschen, während den Proben sekundärer Antikörper (ORB688924) zugesetzt wurde (1:150) und eineinhalb Stunden lang in einen dunklen Inkubator bei 37 °C gestellt wurde. Schließlich wurde nach dem Waschen der Objektträger der Farbstoff DAPI (D9542 – Sigma) in einem dunklen Raum zugegeben und nach 20 Minuten wurden die Proben gewaschen und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus) beobachtet.

In dieser Studie verwendeten wir einen In-vivo-Röntgen-Mikro-CT-Scanner (LOTUS inVi-vo, Behin Negareh Co., Teheran, Iran) in der Preclinical Core Facility (TPCF) der Medizinischen Universität Teheran. LOTUS-in Vivo verfügt über eine Kegelstrahl-Mikrofokus-Röntgenquelle und einen Flachdetektor. Um die bestmögliche Bildqualität zu erzielen, wurden die Spannung und der Strom der Röntgenröhre auf 50 kV bzw. 150 μA und die Bildbelichtungszeit auf 2 s bei 1,4-facher Vergrößerung eingestellt. Die Gesamtdauer des Scans betrug 49 Minuten. Die Schichtdicke der rekonstruierten Bilder wurde auf 47 µm eingestellt. Der gesamte Protokolleinstellungsprozess wurde von der LOTUS-in Vivo-ACQ-Software gesteuert. Die erfassten 3D-Daten wurden mit LOTUS inVivo-REC durch einen Standardalgorithmus von Feldkamp, ​​Davis, Kress (FDK) rekonstruiert. Zur Analyse der Bilder wurden die Softwares ImageJ und Avizo verwendet28,29.

Um das Knochenregenerationsvolumen für die Proben zu berechnen, wurde der interessierende Bereich (ROI) mit einem Medianfilter (3 × 3) gefiltert, um Rauschen zu entfernen, und eine Kontrastverstärkung wurde angewendet, um das visuelle Erscheinungsbild der Bilder zu verbessern. Anschließend wurden die Bilder mithilfe von Segmentierungsalgorithmen segmentiert in:

Ein Material für die Kontrollgruppe; Knochenregeneration, die mit Weiß dargestellt wird.

Vier Materialien für Behandlungsgruppen; Knochenregeneration, Gerüst, Nanopartikel und Polymer, die jeweils in Dunkelgrau, Weiß, Hellgrau und Grau dargestellt werden.

Drei Materialien für die Polymergruppe; Knochenregeneration, Gerüst und Polymer, die jeweils in Dunkelgrau, Weiß und Hellgrau dargestellt sind

Abschließend wurde das Verhältnis des Knochenregenerationsvolumens zum Gesamtvolumen berechnet (%).

In diesem Experiment wurde das Volumen der Knochenregeneration in den Kontrollgruppen PCL, PCL/HA und PCL/BG berechnet.

Bewertung von knochenspezifischen Genen der Ratte, einschließlich ALP, BMPR2, Osteocalcin, Runx2, COL1, Smad7 (Inhibitor) auf mRNA-Ebene und einer Reihe von microRNAs, die an der Knochendifferenzierung beteiligt sind, einschließlich miR-20a, miR-125a, miR-17-5p Es wurde eine Echtzeit-PCR durchgeführt. Diese Technik erfordert drei Schritte: 1. RNA-Extraktion 2. Synthese von cDNA 3. qPCR-Technik.

Schritt 1 – RNA-Extraktion Zunächst wurden die Proben manuell in einem Porzellankolben homogenisiert. Um das Zelllysat zu erhalten, wurde Trizol (1 ml) (Kiazist, Iran) zu den Mikroröhrchen der Proben gegeben, dann wurden 200 ml Chloroform (DRM. CHEM, Iran) auf die Proben gegossen und etwa 20 s lang manuell geschüttelt. Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden sie 15 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert (Hettich, Deutschland). Die klare Phase im oberen Teil des Mikroröhrchens, die RNA enthielt, wurde in ein anderes Mikroröhrchen überführt. In die Mikroröhrchen mit der oberen Phase (die RNA enthält) wurden 500 ml Isopropanol (DRM. CHEM, Iran) gegeben und sie wurden mehrmals geschüttelt, um den Inhalt zu vermischen. Anschließend wurden die Mikroröhrchen für einen kurzen Zeitraum von 5 bis 10 Minuten in einen Gefrierschrank mit -20 °C gestellt. Um die RNA auszufällen, wurden die Proben 10 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde abgelassen und das Sediment mit 200 ml Ethanol gewaschen und verwirbelt. Anschließend wurden die Proben bei 7500 U/min und 4 °C zentrifugiert. Schließlich wurde der Überstand abgelassen und das Mikroröhrchen 15 Minuten lang kopfüber auf ein Papiertuch gelegt, um den Alkohol zu verdampfen. Um das RNA-Sediment aufzulösen, wurden den Mikroröhrchen 20 ml DEPC- oder RNase-freies Wasser (Thermo, USA) zugesetzt. Die extrahierte RNA wurde dann in einem Gefrierschrank bei –80 °C gelagert.

Schritt 2 – Synthese der cDNA Nach dem Auftauen der extrahierten RNA wurden sie auf Eis gelegt und eine Weile gevortext. Um cDNA herzustellen, mischen Sie 5 µl RT-Mix (einschließlich RT-Puffer, RT-Enzym, Random-Hexamer-Primer), 1 µl Oligodt-Primer und 1 µl DEPC-Wasser und mischen Sie 1 µl RNA zu diesem Volumen von 9 µl in Mikroröhrchen ( 0,2 ml) wurde hinzugefügt (Easy cDNA Synthesis Kit, Iran). Sie wurden gemäß dem folgenden Temperaturprogramm (Tabelle 1) in den Thermocycler (KIAGENE, Iran) gegeben.

Schritt 3 – qPCR-Technik Zuerst haben wir alle für die Echtzeit-PCR benötigten Materialien aus dem Gefrierschrank genommen und nach dem Vortexen auf Eis gelegt. Dann bereiteten wir gemäß Tabelle 2 eine Mischung verschiedener PCR-Komponenten für jedes Gen vor und nach dem Mischen wurden 9 μl in jedes Mikroröhrchen gegossen und 1 μl der cDNA in jedes Fläschchen gegeben (das Endvolumen jedes Fläschchens beträgt). 10 μl). Nach dem Mischen und Vortexen wurden die vorbereiteten Mikroröhrchen mit der PCR-Reaktion gemäß dem Ausführungsprogramm von Tabelle 3 in das Gerät (Echtzeit-PCR-Thermocycler, ABI Stepone, USA) gegeben. Am Ende wurden die Daten einschließlich der CT-Nummern (Schwellenzyklus) angezeigt ) steht die Schmelzkurve jedes Gens zur Analyse bereit. Die relative Expression von Genen und MicroRNAs wurde mithilfe von 2−ΔΔCT berechnet. Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 4 dargestellt und U6 wurde als interne Kontrolle verwendet.

In diesem Experiment wurden 30 Ratten ausgewählt und in fünf Gruppen eingeteilt: vier Gruppen mit Gerüstimplantation und eine Gruppe ohne Implantation (n = 6). Die Ergebnisse wurden mit der GraphPad-Software analysiert. Zum Vergleich der Ergebnisse wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) ausgewählt. Als Signifikanzniveau wurde ein P-Wert < 0,05 angenommen. In allen Grafiken werden die Buchstaben a, b, c und d verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen darzustellen.

Die experimentellen Methoden wurden vom Iran National Committee for Ethics Biomedical Research (IR.IAU.SRB.REC.1401.344) genehmigt.

Nach der Behandlung der Gerüste mit Nanopartikeln wurden die Oberflächenmorphologien der PCL/HA-, PCL/BG- und PCL/HA/BG-Gerüste durch FeSEM charakterisiert, um eine ordnungsgemäße Beschichtung der Gerüstoberfläche mit Biokeramik sicherzustellen. Wie aus den mikroskopischen Aufnahmen (Abb. 1b–d) hervorgeht, sind bei starker Vergrößerung biokeramische Partikel auf der Oberfläche von Gerüsten zu erkennen und die Oberfläche von Gerüsten ist gut mit Nanopartikeln bedeckt. Darüber hinaus ist in Abb. 1a die Makroskopie des PCL-Gerüsts dargestellt. Außerdem wurde die Auswirkung der Oberfläche der Gerüste auf die Zelladhäsion und -verteilung untersucht, indem an den Tagen 7 und 14 hAMSCs auf PCL-, PCL/HA-, PCL/BG- und PCL/HA/BG-Gerüsten ausgesät wurden. FeSEM-Bilder zeigten, dass die 3D -gedruckte PCL-Gerüste und die mit den Nanopartikeln modifizierten Gerüste könnten als geeignete Substrate für die Anlagerung von hAMSCs dienen (Abb. 2a,b).

(a) FeSEM-Bilder von hADSCs, die auf den Gerüsten PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG an Tag 7 kultiviert wurden. (b) FeSEM-Bilder, die hADSCs darstellen, die auf den Gerüsten PCL, PCL/HA, PCL/BG kultiviert wurden. PCL/HA/BG-Gerüste an Tag 14.

Histologische Analyse von Schädeldefekten mit und ohne implantierte Gerüste über einen Zeitraum von einem Monat nach der Operation. Die Ergebnisse werden in den folgenden Unterabschnitten aufgeführt.

In allen Gruppen ist eine neue Knochenbildung zu beobachten, aber Ratten, denen Gerüste, insbesondere PCL/Nanobiokeramik-Gerüste, implantiert wurden, zeigten eine bessere Ossifikation. Die Gruppen PCL/HA/BG zeigen die besten Ergebnisse hinsichtlich der Knochenneubildung, gefolgt von den Gruppen PCL/BG und PCL/HA, wobei sich in dieser Hinsicht kein signifikanter Unterschied zeigt. In den mit H&E gefärbten Proben wurde auch eine Zählung der Osteoblasten und Osteozyten durchgeführt. Hinsichtlich der Anzahl dieser Zellen gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Kontroll- und PCL-Gruppen, aber die drei Gruppen PCL/HA/BG, PCL/HA und PCL/BG wiesen mehr Osteozyten- und Osteoblastenzellen auf in dieser Hinsicht zeigten sie einen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe. Die höchste Anzahl an Knochenzellen wurde in der PCL/HA/BG-Gruppe gezählt (Abb. 3a,d).

3D-gedruckte PCL/HA/BG-Gerüste beschleunigten die Regeneration von Schädelknochendefekten bei Ratten. (a) Mikroskopisches Erscheinungsbild des Gewebeschnitts nach H&E-Färbung 30 Tage nach der Operation. (b) Diagramm der Knochenneubildung, (c) Zählung der Osteoblasten (d): Zählung der Osteozyten in den Gruppen PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG.

Eine Färbung mit Alizarinrot wurde durchgeführt, um das Ausmaß der Mineralisierung des Gewebes zu beobachten, das sich zu einem bestimmten Zeitpunkt gebildet hatte. Bereiche mit neuer Knochenbildung wurden mit der Image J-Software bewertet. Wie in Abb. 4a,b dargestellt, war die höchste Mineralisierungsmenge mit dem PCL/HA/BG-Gerüst verbunden, sodass auch bei den beiden Gruppen PCL/HA und PCL/BG ein signifikanter Unterschied besteht. Die mit Nanopartikeln beschichteten Gerüste zeigten einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur PCL-Gruppe und der Kontrollgruppe hinsichtlich der Knochenbildung, während zwischen der Kontroll- und der PCL-Gruppe kein signifikanter Unterschied festgestellt wurde.

(a) Mikroskopisches Erscheinungsbild des Gewebeschnitts nach Alizarinrot-Färbung 30 Tage nach der Operation. (b) Diagramm der Alizarinrot-Färbung eines Gewebeschnitts 30 Tage nach der Implantation in den Gruppen PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG.

Um die Knochenregeneration zu bewerten, wurde auch eine Masson-Trichrom-Färbung durchgeführt (Abb. 5a, b), um die neu gebildete Knochen- und Kollagenablagerung innerhalb der implantierten Konstrukte einen Monat nach der Implantation zu zeigen. Die Daten der Masson-Trichrom-Färbung zeigten außerdem, dass die PCL/HA/BG-Gruppe im Vergleich zur Kontroll- und PCL-Gruppe die beste Knochenintegration und die Zunahme neuer Knochenregionen in den PCL/HA- und PCL/BG-Gruppen aufwies. Die aus der Färbung der Proben erhaltenen Bilder wurden im Hinblick auf die Einstufung der Knochenreparatur basierend auf der Forschungsarbeit von Maliki Gerji30 analysiert. Die Daten zeigten, dass reifer Knochen nur in geringer Menge in der PCL/HA/BG-Gruppe produziert wurde, während in den PCL/BG- und PCL/HA-Gruppen eine unreife Knochenbildung stattfand.

Knochenregeneration, bewertet durch Masson-Trichrom-Färbung. (a) Massons Trichrom-Färbung wurde durchgeführt, um die Kollagenablagerung und den neu gebildeten Knochen innerhalb der implantierten Region 30 Tage nach der Operation zu zeigen. (b) Diagramm der Masson-Trichrom-Färbung in den Gruppen PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG.

Osteocalcin und Osteonectin sind Marker für Knochengewebe. Um den Grad der Kalvarienknochenregeneration in verschiedenen Rattengruppen zu untersuchen, wurde die spezifische Expression zweier Proteine, Osteocalcin und Osteonectin, mit der IHC-Methode analysiert. Wie in Abb. 6a,b gezeigt, wurde die höchste Menge an Osteocalcin- und Osteonectin-Proteinen in den PCL/HA/BG-Gruppen beobachtet. PCL/HA- und PCL/BG-Gruppen belegten hinsichtlich der Anwesenheit dieser beiden Proteine ​​den zweiten Platz. Die Menge an Osteonektin und Osteocalcin war bei den Ratten, die ohne Implantation eine Schädigung im Schädeldachbereich aufwiesen, sehr gering.

Immunhistochemische Färbung des implantierten Gewebeabschnitts 30 Tage nach der Operation in den Gruppen PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG. (a) Die Menge an Osteocalcin-Protein im implantierten Gewebeabschnitt. (b) Die Menge an Osteonectin-Protein im implantierten Gewebeabschnitt.

Die aus dem Mikro-CT-Scan gewonnenen Bilder zeigten, dass die beste Kalvarienknochenregeneration bei den Ratten stattfand, die das PCL-Gerüst mit HA-Nanopartikeln erhielten. Bei den Ratten, denen die PCL/BG-Gerüste implantiert wurden, kam es ebenfalls zu einer gewissen Knochenreparatur, aber die Kontrollratten und die Ratten, die das PCL-Gerüst ohne Nanopartikel erhielten, schnitten in Bezug auf die Regeneration des Kalvarienknochens sehr schlecht ab. Die analysierten 2D-μCT- und 3D-μCT-Bilder sind auch in Abb. 7a, b dargestellt.

Die analysierten 2D-μCT- und 3D-μCT-Bilder der Kalvarienknochenregeneration fanden bei Ratten statt, die die PCL-, PCL/HA-, PCL/BG-, PCL/HA/BG-Gerüste erhielten, sowie bei der Kontrollgruppe ohne Implantation. (a) 3D-μCT-Bilder, (b) 2D-μCT (Die Software ImageJ und Avizo wurden zur Analyse der Abbildungen verwendet).

Das Verhältnis des Knochenregenerationsvolumens zum Gesamtvolumen in der PCL/HA-Gruppe wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe berechnet. Die Knochenregenerationsrate bei Ratten, die PCL/HA-Gerüste erhielten, betrug 2,5297 %, während sie bei Ratten mit Knochendefekt ohne Implantation (Kontrolle) bei 0,2517 % lag, was mehr als das Zehnfache der Regeneration bedeutet. Auch dieses Verhältnis betrug in den PCL- und PCL/BG-Gruppen 0,1057 bzw. 0,1480.

Um das Expressionsniveau von Osteoblastenmarkern auf mRNA-Ebene zu bewerten, wurde eine Echtzeit-PCR durchgeführt. Die relative Expression der Gene ALP, Col1, Osteocalcin, BMPR2 und Runx2 wurde gemessen, um die Knochendifferenzierung und die Regeneration des Kalvarienknochens zu untersuchen. Die höchste Expression der ALP-, Col1- und Osteocalcin-Gene wurde in den PCL/HA/BG-Gruppen beobachtet, sodass sich die Expression dieser Gene in den PCL/HA/BG-Gruppen deutlich von den PCL-, PCL/HA- und PCL/BG-Gruppen unterschied. BG-Gruppen und die Kontrollgruppe. Es ist zu beachten, dass dieser Unterschied bei der COL1-Genexpression geringer war. Außerdem war das Expressionsniveau von BMPR2 in PCL/HA/BG-Gruppen signifikant höher als in anderen Gruppen. Die Analyse der Runx2-Genexpression in den vier getesteten Gruppen und der Kontrollgruppe zeigte, dass die PCL/HA/BG-Gruppe einen signifikanten Unterschied zu den anderen Gruppen aufwies, während die PCL/BG-Gruppe ebenfalls einen Unterschied zur PCL- und Kontrollgruppe aufwies Dieser Unterschied wurde in geringerem Maße auch bei der PCL/HA-Gruppe beobachtet. Das Smad7-Gen spielt eine antagonistische und hemmende Rolle bei der TGFβ/BMP-Signalübertragung. In dieser Studie wurde die niedrigste Expression von smad7 in PCL/Biokeramik ermittelt und zeigte einen signifikanten Unterschied zur Kontrolle (Abb. 8a–f).

Bewertung der relativen Expression knochenspezifischer Rattengene auf mRNA-Ebene und der MicroRNA-Expression im Gewebeimplantationsbereich in den Gruppen PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG nach 30 Tagen nach der Operation. (a) ALP, (b) COL1, (c) Osteocalcin, (d) BMPR2, (e) Runx2, (f) Smad7, (g) miR-20a, (h) miR-17-5p, (i) miR -125a.

Abbildung 8g–i zeigte, dass es in den vier Gruppen mit implantierten 3D-gedruckten Gerüsten unterschiedliche Ausprägungen von miR-20a, miR-17-5p und miR-125a im Verhältnis zueinander sowie zur Kontrolle ohne Implantation gibt. Ein zunehmender Trend der Expression von miR-20a als positivem Regulator wurde 30 Tage nach der Operation deutlich bei den Ratten beobachtet, die PCL/HA/BG erhielten, im Vergleich zur Kontroll- und PCL-Gruppe und sogar zu den PCL/HA-Gruppen. Allerdings gab es keinen signifikanten Unterschied in der Expression von miR-17-5p in den Versuchsgruppen. MiR-125a wurde als negativer Regulator im Osteogeneseweg herunterreguliert. PCL/HA/BG-Gruppen zeigten im Vergleich zu anderen Gruppen die niedrigste Expression von miR-125a.

Die Calvaria hat eine dünne und kugelförmige Struktur. Autologer Knochen und allogene Knochentransplantate können große Schädeldachdefekte nicht effektiv regenerieren. Klinisch gesehen benötigen Schädeldefekte ein geeignetes Gerüst zur Reparatur31. Um solche Probleme zu lösen, wurden in großem Umfang Metall-, anorganische und Polymermaterialien entwickelt32,33. Angesichts der Tatsache, dass der Schädeldachdefekt von Patienten eine personalisierte Form hat, eröffnet die 3D-Druckverarbeitungstechnologie eine neue Richtung für die Herstellung personalisierter Gerüste von Schädeldachdefekten auf der Grundlage von CT-Daten des Patienten34. FDM ist eine der beliebtesten 3D-Drucktechniken, die sich zur Herstellung von Polymergerüsten unter Verwendung von Wärme eignet. Das bei dieser Technik verwendete Material ist Polymer oder eine Kombination aus Polymer und Keramik. Bei dieser Methode wird das gewünschte Material durch Hitze geschmolzen und aus der Düse gedrückt und Schicht für Schicht abgeschieden und es entsteht ein Gerüst. Die Prozesstemperatur hängt von der Schmelztemperatur des Strukturmaterials ab35. PCL ist eines der am besten untersuchten Polymere und unterstützt nachweislich Knochenzellen. PCL zeigt eine geringe entzündliche und immunologische Stimulation, aufgrund seiner Biokompatibilität hat die FDA die Verwendung von PCL zugelassen.

Die Knochenbioaktivität und die Zellaffinität synthetischer Polymere sind schwach und es wurde über einige Abbauprobleme, mechanische Probleme und ein saures Zellmilieu berichtet. Im Fall von PCL kann die Zugabe von BG als Keramikphase dessen inhärente hydrophobe Natur und schlechte Zelladhäsion ausgleichen und auch seine mechanischen Eigenschaften verbessern36. Durch Oberflächenmodifikation von Polymergerüsten mit Biokeramiken wie HA, BG, Tricalciumphosphat (TCP) und Calciumsilicat (CS) als Biomaterialien auf Basis von Calcium, Phosphat und Silicat wirkt diese Verbindung auf die Zellen und verbessert die Osteogenese37. Es gibt viele Hinweise darauf, dass die Topographie die Differenzierung von Stammzellen beeinflusst38,39,40. Beispielsweise haben wir in unserer vorherigen Studie die Wirkung der Oberflächenmodifikation von Polymergerüsten mit Biokeramik auf die Knochendifferenzierung von Stammzellen gezeigt20. Der Einfluss der Topographie auf die Knochenregeneration in vivo ist jedoch weniger klar. In dieser Studie wurde das Potenzial von hergestellten 3D-gedruckten Gerüsten ohne und mit nachträglicher Modifikation bei der Knochenneubildung anhand eines Calvaria-Knochendefektmodells bei Ratten bewertet. Vor In-vivo-Experimenten wurde das Potenzial von PCL-, PCL/HA-, PCL/BG- und PCL/HA/BG-Gerüsten bei der Zellanhaftung unter Verwendung von hAMSCs an den Tagen 7 und 14 nach der Zellaussaat durch FeSEM bewertet. Die SEM-Analyse ergab, dass die vier Gerüstgruppen als hervorragende Oberfläche für die Zellanheftung dienten. Die Zellen dehnten sich auf den Gerüsten aus, um eine Zellschicht zu bilden, und die neu proliferierenden Zellen kommunizierten miteinander, die in die Poren des Gerüsts gegossen wurden. In PCL-Biokeramikgerüsten wurde die Wechselwirkung zwischen dem Polymer, den Nanopartikeln und den Zellen beobachtet und die Zelldehnung auf den Nanopartikeln war signifikant. Bei PCL-Biokeramikgerüsten verbesserten die Rauheit der Oberfläche und die Hydrophilie von HA und BG die Zellbindung.

Für In-vivo-Experimente wurde, nachdem sichergestellt wurde, dass die Ratten bewusstlos waren, die Kopfhaut im Bereich des Schädeldachs der Ratte entfernt und genau in der Mitte des Schädels wurde ein Bereich mit dem Durchmesser der hergestellten Gerüste (6 mm) vom Schädeldach der Ratte entfernt Knochen und die 3D-gedruckten Gerüste, die an der Stelle der Calvaria-Schädigung implantiert wurden41,42. Nach 30 Tagen wurden fünf Gruppen von Ratten, darunter: Kontrollratten (ohne Implantation), PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG, erneut anästhesiert, ihnen wurden die Köpfe abgeschnitten und der transplantierte Teil wurde von den Ratten getrennt. Köpfe. Proben für die histologische Analyse, die IHC, H&E, Massons Trichrom, Alizarinrot-Färbung und Mikro-CT-Scan umfassten, wurden in 10 % Formalin gelegt und zur Bewertung der Expression von Genen und microRNAs, die an der Knochendifferenzierung beteiligt sind, durch Echtzeit-PCR bei –70 °C platziert .

Die H&E-Ergebnisse zeigten, dass die Ratten mit Gerüstimplantation im verletzten Bereich einen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe ohne Gerüstimplantation hinsichtlich der Bildung neuer Knochen und einer besseren Reparatur aufwiesen. Die beste Gruppe war jedoch die PCL/HA/BG. Die Zellzählung von Osteoblasten und Osteozyten ergab, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontroll- und der PCL-Gruppe gab, die PCL/HA/BG-, PCL/HA- und PCL/BG-Gruppen jedoch eine größere Anzahl an Osteozyten- und Osteoblastenzellen aufwiesen. Die höchste Anzahl an Knochenzellen wurde in der PCL/HA/BG-Gruppe gezählt. Massons Trichrom-Färbung wurde verwendet, um die Bildung neuer Knochen und die Kollagenablagerung in den implantierten Konstrukten zu zeigen. Die Daten zeigten, dass reifer Knochen in der PCL/HA/BG-Gruppe nur in geringer Menge vorhanden war und in den PCL/BG- und PCL/HA-Gruppen eine unreife Knochenbildung stattfand. Eine Färbung mit Alizarinrot wurde durchgeführt, um den Grad der Mineralisierung des beschädigten Teils der Schädeldecke zu bewerten, und die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen der Trichrom- und H&E-Färbung von Masson verglichen. Die Analyse der Ergebnisse ergab eine gute Mineralisierungsrate bei PCL/HA/BG-Gerüsten, die im Bereich der Schädeldachverletzung implantiert wurden, sodass diese Gruppe hinsichtlich der Mineralisierungsrate einen signifikanten Unterschied zu den PCl/HA- und PCL/BG-Gruppen aufweist. Die PCL- und Kontrollgruppe wiesen die geringste Menge auf und es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden. Insgesamt zeigten mit Biokeramik beschichtete PCL-Gerüste in diesem Test bessere Ergebnisse als die Kontrollgruppe und sogar PCL allein. Tatsächlich verbesserte die Anwesenheit von HA- und BG-Biokeramiken die Knochenregeneration. Um das Ausmaß der Schädelknochenreparatur in verschiedenen Gruppen getesteter Ratten zu untersuchen, wurde vom IHC die spezifische Expression zweier Proteine, Osteocalcin und Osteonectin, als Marker für Knochengewebe untersucht. Die höchsten Mengen an Osteocalcin- und Osteonectin-Proteinen wurden in der PCL/HA/BG-Gruppe beobachtet. PCL/HA- und PCL/BG-Gruppen befanden sich hinsichtlich der Proteinpräsenz in der zweiten Reihe, und die PCL-Gruppe ohne biokeramische Nanopartikel befand sich in der dritten Reihe. Die Menge an Osteonektin und Osteocalcin war bei Ratten, die einen Defekt im Schädeldachbereich ohne Gerüstimplantation aufwiesen, sehr gering. Daher hat das Vorhandensein biokeramischer Partikel im PCL-3D-Druckgerüst die Expression von Osteocalcin und Osteonectin erhöht, da Yong Sang Cho und seine Gruppe 2019 zeigten, dass die Expression von Osteonectin und Kollagen Typ I im PCL-3D-Druckgerüst geringer war als PCL/HA-Verbundgerüst43. Die aus dem Mikro-CT-Scan erhaltenen Bilder bestätigten die histologischen Analysen und zeigten, dass die beste Kalvarienknochenregeneration bei den Ratten auftrat, die das PCL/HA/BG-Gerüst erhielten. Bei den Ratten mit den PCL/HA- und PCL/BG-Gerüsten kam es ebenfalls zu einer gewissen Knochenreparatur, aber die Kontrollratten und die Ratten, die das PCL-Gerüst ohne Nanopartikelbeschichtung erhielten, schnitten in Bezug auf die Regeneration des Kalvarienknochens sehr schlecht ab. Das Verhältnis des Knochenregenerationsvolumens zum Gesamtvolumen in der PCL/HA-Gruppe wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe berechnet. Die Rate der Knochenregeneration in der PCL/HA-Gruppe betrug 2,5297 %, während sie bei Ratten der Kontrollgruppe bei 0,2517 % lag, was mehr als das Zehnfache der Regeneration bedeutet. Xing et al.44 zeigten die topografische Wirkung von 3D-gedruckten PCL-Gerüsten auf die Steigerung der Proliferation und osteogenen Differenzierung von aus dem Urin stammenden Stammzellen für die Knochenregeneration. Zu diesem Zweck stellten sie PCL-Gerüste mit einer nanotopografischen Oberfläche aus PCL-Partikeln her und verglichen sie in vitro mit PCL-Gerüsten allein. Außerdem untersuchten sie die Wirkung dieser Gerüste auf die Regeneration von Rattenschädelknochen. Ihre Ergebnisse, die auf den Trichrom-Färbetests von H&E und Masson und Mikro-CT-Scans basierten, zeigten, dass der Schädel besser repariert wurde, wenn die PCL-Gerüstoberfläche mit löslichen Polycaprolacton-Partikeln modifiziert wurde44. Xu et al.45 untersuchten die Wirkung des 3D-gedruckten PCL-Gerüsts allein und auch mit Laponit (LAP) auf die Regeneration des Kalvarienknochens von Ratten. Zwölf Wochen nach der Transplantation untersuchte diese Gruppe die Rate der Knochenneubildung im Bereich des Schädeldachdefekts bei Ratten mithilfe von Mikro-CT-Scanbildern und histologischen Analysen wie H&E-, Trichrom- und Alizarinrot-Färbung. Daten und Mikro-CT-Bilder zeigten, dass die Rate der Knochenneubildung bei Ratten, die PCL/LAP-Gerüsttransplantate erhielten, höher war als bei Ratten, die PCL-Gerüsttransplantate erhielten45. Die Wirkung von Verbundgerüsten aus Polyvinylalkohol/β-Tricalciumphosphat/Icariin bei der schnellen und effektiven Reparatur von Schädeldachdefekten, untersucht von Xu et al.46. Ähnlich wie in dieser Studie erzeugte diese Gruppe eine kreisförmige Läsion im mittleren Bereich des Scheitelbeins der Schädeldecke. Mikro-CT-Scanbilder und histologische Analysen der H&E- und Masson-Trichrom-Färbung zeigten, dass die Ratten mit Defekt ohne Gerüst selbst bis zur 12. Woche keine nennenswerte Reparatur aufwiesen, aber bei den Ratten mit einer Gerüstimplantation hatten neue Knochen einige der Löcher gefüllt das Gerüst46. Darüber hinaus wurde die relative Expression der Gene ALP, Col1, Osteocalcin, BMPR2, Runx2 und smad7 mit der Echtzeit-PCR-Methode gemessen, um die Knochendifferenzierung und die Regeneration des Kalvarienknochens zu untersuchen. Die beste Expression der Knochengene ALP, Col1 und Osteocalcin wurde in der PCL/HA/BG-Gruppe beobachtet, sodass sich die Expression dieser Gene in der PCL/HA/BG-Gruppe im Vergleich zu PCL, PCL/HA, PCL/BG und der Kontrollgruppe deutlich unterschied . Die Analyse der Runx2-Genexpression in den vier Gruppen und der Kontrolle ergab, dass die Dreikomponenten-PCL/HA/BG-Gruppe einen signifikanten Unterschied zu anderen Gruppen aufwies und dass die PCL/BG-Gruppe ebenfalls einen signifikanten Unterschied zu den PCL- und Kontrollgruppen aufwies Der Unterschied war in der PCL/HA-Gruppe in geringerem Maße zu beobachten. Runx2 ist ein Transkriptionsfaktor, der an der Knochenbildung beteiligt ist und den Promotor knochenspezifischer Gene wie ALP und COL1 in den frühen Stadien der Knochendifferenzierung aktiviert. Daher ist es sinnvoll, dass das PCL/HA/BG-Gerüst die Mineralisierung der extrazellulären Matrix stimulierte, indem es COL1 synthetisierte, um die Matrix für die Osteoidbildung zu bilden, was auf den Anstieg des Runx2-Spiegels durch HA und BG im PCL/HA/BG-Gerüst zurückzuführen ist . Abschließend wurde der nanotopografische Effekt von 3D-gedruckten Gerüsten auf die Expression von microRNAs (miR-20a, miR-17-5p, miR-125a), die an der BMP-Signalübertragung beteiligt sind, mittels qPCR untersucht. Die osteogene Differenzierung ist ein komplexer Prozess, der durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich microRNAs, reguliert wird. Studien von Zhang et al. im Jahr 2011 zeigten, dass die Expression von endogenem miR-20a während der Knochendifferenzierung zunimmt und gleichzeitig die Expression der Knochenmarker und -regulatoren BMP2, BMP4, Runx2, OSX, OCN und OPN zunahm, während die Expression der Adipozytenmarker PPARy und Die Osteoblastenantagonisten Bambi und Crim1 sind verringert. Sie zeigten, dass miR-20a die osteogene Differenzierung durch Hochregulierung der BMP/Runx2-Signalübertragung durch Stummschaltung von PPARy, Bambi und Crim fördert147,48. In dieser Untersuchung wurde das höchste Maß an miR-20a-Expression bei den Ratten beobachtet, die die PCL/HA/BG-Gerüste erhielten, und das höchste Maß an Runx2- und OCN-Genexpression, die an der BMP/Runx2-Signalisierung beteiligt sind, wurde auch in diesen Gruppen beobachtet . Smad7 spielt eine hemmende Rolle bei der TGF-β/BMP-Signalisierung und wird durch mehrere miRs reguliert. miR-17-5p zielt direkt auf Smad7 in MSCs und fördert die osteoblastische Differenzierung und Zellproliferation26. In dieser Studie gab es keinen signifikanten Unterschied in der Expression von miR-17-5p in den Versuchsgruppen, aber Gruppen mit biokeramischer Beschichtung zeigten eine geringe Expression von smad7 als Inhibitor. Einige Untersuchungen ergaben, dass miR-125a die osteoblastische Differenzierung von hAMSCs negativ reguliert, indem es auf smad abzielt449,50. Aufgrund anderer erhaltener Ergebnisse erwarteten wir daher eine Herunterregulierung von miR-125a in den PCL/HA/BG-Gruppen im Vergleich zur Kontrolle. Dem Diagramm zufolge wurde die Herunterregulierung von miR-125a in PCL/HA/BG-Gruppen im Vergleich zur Kontrolle gezeigt.

Die histologische Färbung zeigte, dass die PCL/HA/BG-Gerüste bei der Knochenregeneration im Schädeldach von Ratten erfolgreicher waren. HA- und BG-Biokeramiken verfügen über osteokonduktive und osteoinduktive Eigenschaften, die zur Osteointegration zwischen dem Wirtsknochen und dem Implantat führen. Topografische Hinweise werden von zellulären Sensoren wie Integrinen erkannt, was zu biochemischen Signalkaskaden führt und die Expression von Genen und Proteinen verändert. Den Ratten wurden PCL/HA/BG-Gerüste implantiert, HA/BG-Nanopartikel stimulierten den BMP-Signalweg. Die BMP-Signalübertragung spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Knocheninduktion, -erhaltung und -reparatur. In der Topographie des PCL/HA/BG-Gerüsts wurden die höchsten Expressionsniveaus von miR20a und miR17-5p (als positive Regulatoren bei der Osteogenese) beobachtet, was durch Hemmung zu erhöhten Knochenmarkern, einschließlich ALP, Col 1, Osteocalcin, BMPR2, RunX2, führte Crim 1, Bambi, PPARY als Osteogenese-Inhibitoren. Außerdem hatte das PCL/HA/BG-Gerüst die Expression des miR-125a-Spiegels als negativen Osteogeneseregulator stärker reduziert. Daher verbesserte das Vorhandensein von HA- und BG-Biokeramiken bei Ratten, die PCL/HA/BG-Implantate erhielten, die BMPs und ALP und führte zu einer Verstärkung der BMP-Signalisierung und einer stärkeren Regeneration des Defektbereichs (Abb. 9).

Schematische Darstellung der Interaktion von miR-20a, miR-125a und miR-17-5p in osteogenen Differenzierungswegen.

Die Ergebnisse der In-vivo-Analyse zeigten, dass schwerwiegende Schädeldefekte die Verwendung eines geeigneten Gerüsts erfordern. Das PCL/HA/BG-Gerüst ist ein geeignetes Gerüst für das Knochengewebe-Engineering und wird für klinische Anwendungen empfohlen.

Klinisch benötigen Schädeldefekte ein geeignetes Gerüst, um große Verletzungen zu regenerieren. Die 3D-Drucktechnologie eröffnet eine neue Richtung für die Herstellung personalisierter Gerüste von Schädeldefekten auf der Grundlage von CT-Daten des Patienten. Die porösen PCL-Gerüste wurden mittels FDM-3D-Druck hergestellt. Die Modifikation der Gerüste nach der Herstellung erfolgte mit HA-, BG- und HA/BG-Biokeramiken. Zunächst wurde das Potenzial der Gerüste zur Anlagerung von hAMSCs in vitro untersucht. Anschließend wurde die Fähigkeit der hergestellten Gerüste zur Rekonstruktion und Knochenneubildung anhand eines Ratten-Calvaria-Knochendefektmodells bewertet. Die Ergebnisse der histologischen und IHC-Analyse, des Mikro-CT-Scans und der Auswertung von Genen und MicroRNAs-Expression, die an der Knochenregeneration beteiligt sind, zeigten, dass im PCL/HA/BG-Gerüst die Wechselwirkung von HA und BG zu einer verbesserten Regeneration des Kalvarienknochens führte und dies geeignet sein könnte Anwendungen im Knochengewebe-Engineering.

Der für die Analyse in diesem Artikel verwendete Datensatz ist auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Nasrin Fazeli & Shiva Irani

Abteilung für Mikrobiologie, Fakultät für Biologie, Hochschule für Naturwissenschaften, Universität Teheran, Teheran, Iran

Ehsan Arefian

Forschungszentrum für urogenitale Stammzellen, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Teheran, Iran

Abdolreza Ardeshirylajimi

Abteilung für Biotechnologie, College of Science, Universität Teheran, Postfach: 141556455, Teheran, Iran

Ehsan Seyedjafari

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NF führte die Experimente durch und schrieb die Arbeit unter meiner Aufsicht (ES) und EA betreute microRNAs. AA überwachte Aspekte des Tissue Engineering. SI überwachte die molekularen Schnitte. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Ehsan Seyedjafari.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Fazeli, N., Arefian, E., Irani, S. et al. Beschleunigte Rekonstruktion des Schädelknochendefekts der Ratte mithilfe von 3D-gedruckten Gerüsten, die mit Hydroxylapatit/Bioglas beschichtet sind. Sci Rep 13, 12145 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38146-1

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Eingegangen: 07. Februar 2023

Angenommen: 04. Juli 2023

Veröffentlicht: 27. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38146-1

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