Transkriptionsprofilierung von Osteosarkomen bei Hunden identifiziert prognostische Genexpressionssignaturen mit translationalem Wert für den Menschen

Jul 24, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 856 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Hunde-Osteosarkom wird zunehmend als aussagekräftiges Modell für das menschliche Osteosarkom anerkannt. Hier zeigen wir in einem der umfangreichsten klinisch kommentierten Transkriptionsdatensätze für Osteosarkome bei Hunden, dass zwei zuvor berichtete sowie De-novo-Gensignaturen, die durch eine Einzelproben-Gen-Set-Anreicherungsanalyse (ssGSEA) erstellt wurden, sowohl bei Menschen als auch bei Hunden prognostischen Nutzen haben. Gemeinsame molekulare Signalwegveränderungen werden bei der Signalübertragung und -aktivierung von Immunzellen beobachtet, einschließlich der TH1- und TH2-Signalübertragung, der Interferonsignalisierung und bei Entzündungsreaktionen. Die virtuelle Zellsortierung zur Schätzung der Immunzellpopulationen in Tumoren von Hunden und Menschen zeigte ähnliche Trends, vor allem bei Makrophagen und CD8+-T-Zellen. Die immunhistochemische Färbung bestätigte das erhöhte Vorhandensein von Immunzellen in Tumoren, die eine Anreicherung von Immungenen aufwiesen. Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse das natürlich vorkommende Osteosarkom des Hundes als translatorisch relevantes Patientenmodell für den Menschen und verbessern unser Verständnis der immunologischen und genomischen Landschaft der Krankheit bei beiden Arten.

Das Osteosarkom (OS) ist eine seltene primäre bösartige Erkrankung des Skeletts im Kindes- und Jugendalter, von der in den USA jedes Jahr weniger als 1.000 Patienten betroffen sind1,2,3,4. Osteosarkome entwickeln sich auch spontan bei Haushunden und machen mehr als 85 % aller bösartigen Erkrankungen des Hundeskeletts aus. Allein in den USA kommt es jedes Jahr zu mindestens 10.000 Neuerkrankungen5,6,7. Bei beiden Arten ist das biologische Verhalten von OS aggressiv und weist eine hohe Neigung zur Metastasierung auf8,9. Da die Ergebnisse für beide Arten seit Jahrzehnten stagnieren, hat der ungedeckte klinische Bedarf das Interesse an der Erforschung von Haushunden mit OS als informativen Modellen für das menschliche OS geweckt10,11,12,13,14. Vergleichende onkologische Studien an tumortragenden Hunden werden durchgeführt, um wichtige Forschungsfragen zur Entdeckung von Wirkstoffzielen und zur gemeinsamen Tumorbiologie zu beantworten und neue Wege zur therapeutischen Optimierung zu erkunden15. Der vergleichende Ansatz erwies sich insbesondere im Kontext der Arzneimittelentwicklung als wirksam und umfasste kleine Moleküle, Biologika, Immuntherapien, Bildgebungsmittel und Kombinationsstrategien13,15,16,17,18,19. Da jedoch Präzisionsmedizin und Immunonkologie in den Vordergrund der Krebsmedikamentenforschung rücken, ist ein detaillierter molekularer Rahmen für Hunde-Osteosarkome erforderlich, um seine translationale Relevanz für den Menschen weiter zu bestimmen und die Entdeckung und Validierung neuer medikamentöser Angriffspunkte zu erleichtern20. Canine OS rekapituliert viele der charakteristischen biologischen und molekularen Merkmale des menschlichen OS, wie z. B. hochgradig neu angeordnete Genome mit ausgedehnten Aberrationen der Kopienzahl und lokalisierter Hypermutation21,22,23. Wie das menschliche OS weisen auch die OS-Genome von Hunden im Allgemeinen keine hochfrequenten aktivierenden/inaktivierenden Mutationen in kanonischen Onkogenen und Tumorsuppressorgenen auf, sondern vielmehr Veränderungen der somatischen Kopienzahl an genomischen Loci, die diese Gene kodieren. Zu den am häufigsten veränderten Genen beim Hunde-OS gehören TP53, CDKN2A und RB121,24,25.

Neben dem Wissen, das die genomische Komplexität des OS beschreibt, besteht die Herausforderung, geeignete präklinische Modelle zu identifizieren und zu nutzen, um die vielversprechendsten Behandlungen für Menschen und Hunde zu priorisieren. Während vom Patienten stammende Xenotransplantate und parallele klinische Studien mit Maus-Avataren zur Identifizierung und funktionellen Validierung verschiedener molekularer therapeutischer Ziele verwendet wurden, zeigt das Fehlen eines intakten Immunsystems, dass die Verwendung dieser präklinischen Modelle zum Testen kombinierter Immuntherapien unzureichend ist26. Die Untersuchung des natürlich vorkommenden OS bei Hunden kann Lücken in der präklinischen Krankheitsmodellierung schließen und gleichzeitig Einblicke in die Biologie einer häufigen bösartigen Erkrankung bei Hunden liefern, da sich OS-Tumoren sowohl bei Menschen als auch bei Hunden spontan entwickeln und fortschreiten, parallel zu einer sich gleichzeitig entwickelnden Tumormikroumgebung und einem intaktes, gebildetes Immunsystem27,28. Dies ist umso bedeutsamer, als die Ergebnisse jüngster klinischer Studien am Menschen, in denen auf Antikörpern basierende Checkpoint-Inhibitoren, CAR-T-Zellen und Immunstimulanzien untersucht wurden, enttäuschend und/oder schwer zu interpretieren oder zu verallgemeinern waren29,30. Die Kombination gezielter molekularer Therapien und/oder Chemotherapien mit relevanten immunmodulatorischen Wirkstoffen stellt eine neue Grenze bei der Behandlung einer Krankheit dar, für die es derzeit keine klare Reihe von medikamentös behandelbaren Antriebsereignissen gibt.

Wie beim Menschen haben biologische Proben, die von an klinischen Studien teilnehmenden Hundepatienten entnommen wurden, aufgrund ihrer standardisierten diagnostischen und therapeutischen Schemata und tiefgreifenden klinischen Anmerkungen das Potenzial, das Fachgebiet zu informieren. Ein klarer Vorteil von Krebspatienten bei Hunden ist in diesem Zusammenhang die Möglichkeit, behandlungsnaive, tumortragende Hunde in therapeutische klinische Studien aufzunehmen, in denen Prüfpräparate bewertet werden. Dadurch erhalten sie Zugang zu Patientenmaterialien, die die Grundwahrheit der Krankheit und eine molekulare Landschaft darstellen frei von behandlungsbedingten Störungen. Die hier vorgestellte Arbeit nutzt eine große Kohorte von Hunde-OS-Proben aus einer prospektiven, randomisierten klinischen Studie, in der über 300 Hunde einer standardisierten Therapie und klinischen Überwachung unterzogen wurden. Dieser Datensatz ist der erste seiner Art, der feststellen könnte, ob die Transkriptionsprofilierung des Hunde-OS bestimmte molekular definierte Patientenuntergruppen und/oder prognostische Gensignaturen bei Hunden, die eine standardisierte Therapie erhalten, identifizieren und bewerten könnte, ob und wie diese Signaturen öffentlich auf das menschliche OS übertragbar sind Verfügbare Daten.

Hier liefern wir starke Belege dafür, dass transkriptomische und klinische Muster, die bei OS-Patienten bei Hunden identifiziert wurden, vergleichbar auf das OS beim Menschen angewendet werden könnten. Weitere Analysen ergaben bei beiden Arten gemeinsame zelluläre Prozesse, was auf ein Transkriptionsprogramm hindeutet, das ein reichhaltiges Zusammenspiel zwischen Tumorzellen und Immunzellen in der Tumormikroumgebung aufweist. Dies bietet ein Sprungbrett für zukünftige Untersuchungen der vergleichenden Einzelkern-Transkriptomik, der epigenomischen Profilierung und raumbezogener Transkriptionsstudien. Darüber hinaus untermauern Hinweise auf gemeinsame zelluläre Prozesse und die damit verbundene Biologie zwischen OS-Primärtumoren bei Hunden und Menschen den Wert des Hundes als Patientenmodell für das OS beim Menschen und bieten Möglichkeiten, diese Signalwege als medikamentöse Ziele bei beiden Arten zu erforschen. Darüber hinaus ermöglichte dieser Datensatz die Bewertung immunbezogener Gensignaturen, die Überprüfung von Immunzell-Subtypen in primären OS-Geweben und die Bestimmung, ob die Quantifizierung von Immunzellen in Tumoren als Ersatz für die Zuordnung von Gensignatur-Clustern dienen kann. In Zukunft werden diese Daten bei der Identifizierung von Untergruppen von Hunden helfen, die als ideale Kandidaten für spezifische therapeutische Tests dienen könnten. Beispielsweise kann die Analyse immunbezogener Gensignaturen Untergruppen von Hunden identifizieren, die eher auf spezifische Immuntherapien reagieren; oder kann darauf hindeuten, dass bestimmte immunspezifische Therapien sinnvoll kombiniert werden könnten, um die Ergebnisse zu verbessern. Mit diesem Verständnis gewinnen wir ein besseres Verständnis der vergleichenden Biologie des OS bei Hunden und Menschen und Einblick in die Faktoren, die sich auf die Patientenergebnisse auswirken.

Um die klinische Bedeutung von zwei zuvor identifizierten Gensignaturen (GS-1 und GS-2)21 zu bewerten, haben wir diese Signaturen auf den DOG2-Datensatz des National Cancer Institute angewendet und K-Mittel-Clustering durchgeführt (Abb. 1). Unabhängig vom klinischen Ergebnis wurden die Daten in zwei verschiedene Cluster unterteilt, die durch die Expression von GS-1-Genen definiert wurden (Abb. 2a). Weitere Analysen ergaben, dass die erhöhte Anreicherung von GS-1 im Vergleich zu dem durch verringerte GS-1-Anreicherung definierten Cluster mit einem deutlich verbesserten DFI (Abb. 2b) und OSv (Abb. 2c) verbunden war. Daher wurden diese GS-1-Cluster später als Gruppen mit günstiger Prognose (FP) bzw. Gruppen mit schlechter Prognose (PP) bezeichnet. In ähnlicher Weise bildete die K-Mittel-Clusterbildung von GS-2 Cluster (Abb. 2d), die signifikant mit DFI (Abb. 2e) und OSv (Abb. 2f) korrelierten.

ein allgemeiner Arbeitsablauf für die Anwendung von GS-1- und GS-2-Gensignaturen und nachgelagerte Analysen. Die mRNA wird auf eine Genexpressionssignatur heruntergefiltert, gefolgt von K-Means-Clustering, unabhängig von zugehörigen Ergebnisdaten. Cluster werden mehreren Modi der Sekundäranalyse unterzogen, um Unterschiede im klinischen Ergebnis, unterschiedlich exprimierte Gene und Signalwege sowie die Entfaltung von Immunzelltypen mit immunhistochemischer Validierung im Gewebe zu erkennen. b Allgemeiner Arbeitsablauf für Signaturen des iterativen Suchalgorithmus (ISA), die aus mRNAseq-Daten der DOG2-Kohorte von Hunden erstellt wurden. K-Means-Clustering wird für ssGSEA-Ergebnisse durchgeführt, die als Eingabe für eine sekundäre DEG-Analyse verwendet werden. Anschließend wird ISA-Bi-Clustering an den DEGs durchgeführt, wodurch neue Gensignaturen entstehen. Diese neuen ISA-Signaturen werden dann auf den menschlichen TARGET-Datensatz angewendet, um festzustellen, ob die Signaturen Cluster mit bedeutenden Überlebensunterschieden definieren.

ein Expressionsprofil über GS-1-Cluster auf DOG2-Daten. Die beiden durch GS-1 identifizierten unterschiedlichen Cluster weisen deutlich unterschiedliche Kaplan-Meier-Kurven für das krankheitsfreie Intervall (DFI, b) und das Gesamtüberleben (OSv, c) auf, beide angegeben in Tagen ab Diagnose. Expressionsprofile über GS-2-Cluster hinweg auf DOG2-Daten (d). Die von GS-2 identifizierten Cluster weisen deutlich unterschiedliche DFI (e) und OSv (f) auf.

Um die Relevanz der Hunde-GS-1- und GS-2-Signaturen für das menschliche Betriebssystem zu bewerten, haben wir dieselbe Analyse auf den menschlichen TARGET-Datensatz angewendet. Wie bei Hunden führte die K-Mittel-Clusterung der GS-1-Signatur zu einer günstigen Prognose und einer Gruppe mit schlechter Prognose, was das progressionsfreie Überleben (PFS) und das Gesamtüberleben betrifft (Abb. 3a – c). Die aus der Clusterbildung der GS-2-Signatur resultierenden Gruppen waren jedoch nur für das Gesamtüberleben von Bedeutung (Abb. 3d – f). Als nächstes untersuchten wir, wie das Krankheitsstadium die Gesamtclusterzusammensetzung im TARGET-Datensatz beeinflusst, der Daten enthält, die von Primärtumoren menschlicher Patienten mit (n = 20) und ohne (n = 59) Anzeichen von makroskopischen Metastasen zum Zeitpunkt der Diagnose stammen. Bei der Anwendung von GS-1- und GS-2-Signaturen auf nicht metastasierte Patienten wurden keine signifikanten Unterschiede im PFS oder im Gesamtüberleben festgestellt (ergänzende Abbildung 1). Bei Patienten mit Metastasierung ordnet die GS-1-Signatur jedoch 5 Patienten der FP-Gruppe und 15 der PP-Gruppe zu (ergänzende Abbildung 2a). Wie erwartet waren sowohl das progressionsfreie Überleben als auch das Gesamtüberleben signifikant unterschiedlich (ergänzende Abbildung 2b, c). Bei der Anwendung von GS-2 auf metastasierte Proben gruppierten sich 4 Patienten in der FP-Gruppe und 16 in der PP-Gruppe (ergänzende Abbildung 2d). Das progressionsfreie Überleben war nicht signifikant (p = 0,081), das Gesamtüberleben jedoch (p = 0,044) (ergänzende Abbildung 2e, f). Dieser Befund bestätigt die seit langem anerkannte Auswirkung des Vorliegens einer metastasierenden Erkrankung zum Zeitpunkt der Diagnose als den prädiktivsten Einzelfaktor sowohl für Hunde- als auch für Menschenpatienten mit OS31 und unterstreicht die Notwendigkeit, Mechanismen klarer zu definieren, die Transkriptionsprogramme und andere genomische Prozesse innerhalb der Primärerkrankung verknüpfen Tumoren zur Biologie der Metastasenprogression8,14,32.

Expressionsprofil der von Hunden abgeleiteten Gensignatur GS-1, angewendet auf Cluster auf TARGET-Daten (menschliche Osteosarkome) (a). Die durch GS-1 identifizierten Gruppen weisen deutlich unterschiedliche Kaplan-Meier-Kurven für das progressionsfreie Überleben (PFS, b) und das Gesamtüberleben (OSv, c) auf. d Das Expressionsprofil der vom Hund abgeleiteten Gensignatur GS-2. Im Gegensatz zu GS-1 weisen GS-2-Cluster keinen deutlichen Unterschied im PFS (e) auf, weisen jedoch signifikante Unterschiede im OSv (f) auf. Das mittlere PFS und OSv wird in Tagen ab der Diagnose angegeben.

Um die Kontextrelevanz der Gensignaturen sicherzustellen, führten wir eine GSEA mit den msigDB-Hallmarks-Signaturen der Version 7.5 durch33. Unter Verwendung der mit GS-1 gebildeten Cluster wurden 10 Pfade in den DOG2-Daten (Abb. 4a) und 12 Pfade in den TARGET-Daten (Abb. 4b) in der Gruppe mit günstiger Prognose (FP) signifikant angereichert. Darüber hinaus waren alle 10 signifikant angereicherten Signalwege in der DOG2-FP-Gruppe auch in der TARGET-FP-Gruppe signifikant, einschließlich Signalwegen im Zusammenhang mit Immunfunktion und Entzündungen wie Interferon Alpha/Gamma, Komplementsystem, IL2-STAT5-Signalisierung, Kras34 und Tumornekrosefaktor-Signalisierung . Wenn nur die nicht metastasierten TARGET-Proben berücksichtigt wurden, hatten 11 der insgesamt 12 Pfade einen FDR von weniger als 0,05 (Abb. 4c), angereichert in der FP-Gruppe. Ebenso hatten nur 7 Signalwege eine signifikante FDR in der TARGET-Kohorte, die nur Metastasen enthielt (Abb. 4d). Die auf den von GS-2 bereitgestellten Clustern basierende GSEA-Analyse hatte alle die gleichen signifikanten Signalwege wie GS-1, umfasste jedoch den Signalweg für reaktive Sauerstoffspezies für alle drei Datensätze und die Apoptose für DOG2 (ergänzende Abbildung 3). In der Gruppe mit schlechter Prognose (PP) wurden für keine der beiden Signaturen Signalwege signifikant angereichert (ergänzende Abbildungen 4, 5).

Normalisierte Anreicherungswerte für die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) der 20 wichtigsten Signalwege, die in der Gruppe mit günstiger Prognose im Vergleich zur Gruppe mit schlechter Prognose überrepräsentiert sind, wenn sie nach GS-1 in (a) DOG2, (b) TARGET, (c.) geclustert werden ) TARGET-Patienten ohne Metastasen und (d) TARGET-Patienten mit Metastasen. Die Punktgröße ist repräsentativ für die Anzahl der Gene im Signalweg und die Farbe gibt den von der Software berechneten FDR-q-Wert an, die rote Linie zeigt den Signifikanz-Cutoff an. Ähnliche Diagramme für GS-2 und Signalwege, die in der Gruppe mit schlechter Prognose überrepräsentiert sind, finden sich in den ergänzenden Abbildungen. 3–5.

Eine Analyse der differentiellen Expression, gefolgt von einer Signalweganalyse, wies erneut auf überlappende biologische Prozesse und Signalwege hin, die für die Unterscheidung von durch GS-1 gebildeten Gruppen mit günstiger und schlechter Prognose relevant sind. Für DOG2 gab es 317 DEGs, 220 (69,4 %), die nicht in GS-1 oder GS-2 vertreten waren. Für TARGET, einschließlich aller 79 Proben, gab es 281 DEGs, von denen 233 (83 %) nicht in GS-1 oder GS-2 enthalten waren. Ebenso gab es für die 59 nicht metastasierten Proben 321 DEGs, von denen 270 (84,1 %) nicht in GS-1 oder GS-2 enthalten waren. In den 20 metastatischen Proben gab es insgesamt 9 DEGs. Fünf überlappten mit dem 79 Patienten umfassenden TARGET-Datensatz (IL2RB1, MSA4A, PCED1B, S100A9, TMEM176B0), zwei mit DOG2 (DOCK2, TMEM176B) und zwei waren einzigartig für diese Kohorte, EMB und C11orf87. Es gab 84 gemeinsame DEGs für alle drei Datensätze (DOG2, TARGET (alle Patienten), TARGET (nicht metastasierte Patienten)), von denen 47 (56 %) nicht in GS-1 oder GS-2 lagen. Listen aller DEGs und Pfade finden Sie in der Datendatei 2 der ergänzenden Materialien.

Die IPA-Analyse der 84 DEGs, die zwischen den Datensätzen von Hunden und Menschen geteilt wurden, ergab mehrere gemeinsame immunbezogene Signalwege von Interesse, insbesondere TH1- und TH2-Signalisierung, Übersprechen zwischen dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen, NFκβ-Signalisierung, Signalweg für den immunogenen Zelltod und IL-8 Signalisierung (Ergänzende Abb. 6a). Zusätzlich zu den 84 gemeinsam genutzten DEGs wurden viele der DEGs, die nur in den DOG2- oder TARGET-Datensätzen vorkamen, für dieselben IPA-Signalwege angereichert (ergänzende Abbildung 6b), einschließlich des PD-1-PD-L1-Krebsimmuntherapie-Signalwegs, des IL- 10-Signalweg sowie IL-12-Signalisierung und -Produktion in Makrophagen. Zu den signifikanten Signalwegen in DOG2, jedoch nicht in TARGET, gehören der Osteoarthritis-Signalweg und der PI3K/AKT-Signalweg, der zuvor mit Osteosarkomen in Verbindung gebracht wurde35. Zu den signifikanten Signalwegen in TARGET, aber nicht in DOG2 gehören IL-17-Signalisierung, T-Zell-Erschöpfung, T-Zell-Rezeptor-Signalisierung, CD28-Signalisierung in T-Helferzellen, Allotransplantat-Abstoßungssignalisierung und alternative Aktivierung des Makrophagen-Signalwegs.

CIBERSORTx wurde verwendet, um anhand der Massen-mRNA-Sequenzierungsdaten auf die zelluläre Zusammensetzung der Immuninfiltrate im Tumorgewebe zu schließen (Abb. 5, Tabelle 1). Die bemerkenswerteste Ähnlichkeit zwischen dem DOG2- und dem TARGET-Datensatz besteht für M0- und M2-Makrophagen. In beiden Datensätzen sind die M0-Makrophagen-CIBERSORT-Scores in der PP-Gruppe signifikant höher als in der FP-Gruppe (Abb. 5a, b). Dies steht im Gegensatz zu den M2-Makrophagen-Scores, bei denen in der FP-Gruppe im Vergleich zur PP-Gruppe ein deutlich höherer Score zu verzeichnen ist (Abb. 5c, d). Darüber hinaus weisen CD8+-T-Zellen, naive CD4+-T-Zellen, follikuläre T-Helferzellen und M1-Makrophagen in den DOG2- und TARGET-Datensätzen deutlich höhere Werte in der FP-Gruppe und niedrigere Werte in der FP-Gruppe auf. Darüber hinaus sehen wir innerhalb der DOG2-FP-Kohorte eine hohe Korrelation zwischen M1-Makrophagen, CD8+-T-Zellen, aktivierten Gedächtnis-CD4+-T-Zellen und Gamma-Delta-T-Zellen (Abb. 5e), die in der PP-Gruppe nicht vorhanden ist (ergänzende Abb. 7a), sinnbildlich für eine adaptive Antitumor-Immunantwort, die durch aktivierte Gedächtnis-T-Zellen ausgelöst und durch M1-Makrophagen und hochzytotoxische CD8+- und Gamma-Delta-T-Zellen orchestriert wird. In ähnlicher Weise deutet innerhalb der TARGET-Kohorte die Korrelation zwischen NK-Zellen, follikulären T-Helferzellen, CD8+ T-Zellen und aktivierten dendritischen Zellen (Abb. 5f) auf eine starke zytotoxische Lymphozytenreaktion in der FP-Gruppe hin, die in der PP nicht vorhanden ist Gruppe (Ergänzende Abb. 7b).

Die M0-Makrophagen-CIBERSORTx-Scores sind in der Gruppe mit schlechter Prognose (PP) signifikant höher als in der Gruppe mit günstiger Prognose (FP) in (a) DOG2 und (b) TARGET. Dies ist das Gegenteil von dem, was bei M2-Makrophagen beobachtet wird, wo in der FP-Gruppe in (c) DOG2 und (d) TARGET durchweg höhere CIBERSORTx-Werte beobachtet werden. Spearman-Korrelationen zwischen CIBERSORTx-Scores in der FP-Gruppe für DOG2 (e) lassen auf eine adaptive Immunantwort schließen, die durch hochkoordinierte Populationen von T-Zellen gekennzeichnet ist. Gleiches gilt auch für die zytotoxische Lymphozytenreaktion (aktivierte NK- und dendritische Zellen, T-Helferzellen und CD8-T-Zellen) in der FP-TARGET-Gruppe (f).

Um festzustellen, ob die relative Häufigkeit von Immunzellen in OS-Geweben von Hunden bestätigt werden konnte, wurden bestimmte Immunzelltypen mithilfe der Immunhistochemie markiert (Ergänzungstabellen 1, 2). Ein Vergleich der immunhistochemischen Analyse mit der GS-1-Signatur ist in Abb. 6a zu sehen. Insgesamt bestätigte die immunhistochemische Untersuchung des OS bei Hunden (Abb. 6b) das Vorhandensein mehrerer Immunzelltypen in der Mehrzahl der der FP-Gruppe zugeordneten OS, darunter T-Zellen (CD3), B-Zellen (CD20, MUM1) und Makrophagen ( CD204, Iba1). Darüber hinaus ergab ein Vergleich zwischen repräsentativen Stichproben der FP- und PP-Kohorten, dass die FP-Gruppe hinsichtlich der Markierung von CD3, CD20, CD204, CD3, CD45RA, Iba1 und MUM 1 deutlich stärker angereichert war (Abb. 6b). Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass immunangereicherte Tumore aus der DOG2-OS-Kohorte von Hunden gleichzeitig von mehreren Subtypen von Immunzellen infiltriert werden. Schließlich zeigen fünf mit CD3, CD20 und CD204 markierte humane OS-Tumorproben die Infiltration von humanem OS durch T-Zellen, B-Zellen bzw. Makrophagen (Abb. 6c). Wie in OS-Geweben von Hunden zu sehen ist, sind CD204+-Zellen zahlreich und werden im gesamten OS-Gewebe von Menschen beobachtet.

Für die immunhistochemische (IHC) Analyse wurde eine Untergruppe von Fällen aus den GS-1-Clustern „schlechte Prognose“ (grün) und „günstige Prognose“ (orange) ausgewählt. a Basierend auf der IHC-Kennzeichnung der entlang der x-Achse aufgeführten Antikörper wurden die Fälle anhand einer 3-Punkte-Skala als hohe Immunität (3+), mittlere Immunität (2+) oder niedrige Immunität (1+) kategorisiert. Iba1 wurde in einer Probe (grau gekennzeichnet) aufgrund schlechter Gewebeschnitte nicht bewertet. Alle anderen Gewebe wurden wie angegeben einbezogen. Die nebenstehende Heatmap zeigt die Genexpression für die IHC-Fälle basierend auf der hierarchischen GS-1-Clusterbildung aller Proben und veranschaulicht die Beziehung zwischen den GS-1-Clustern und der IHC-Kategorie. Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zwischen Clustern bei der IHC-Quantifizierung mit *p < 0,05 und **p < 0,005 hin. b Beispielbilder der IHC-Kennzeichnung aus den Clustern Schlechte Prognose (Grün) und Günstige Prognose (Orange). c Beispielbilder der IHC-Markierung für CD3, CD20 und CD204 in menschlichen OS-Proben. Maßstabsbalken = 50 µm.*IHC-Etiketten für Abb. B und C stellen IHC-Chromogen (entweder rot oder braun) dar, das zur Markierung positiver Zellen verwendet wird.

Die Signaturen GS-1 und GS-2 stammen von Gardner et al. Die hierin bewerteten und bewerteten Ergebnisse lieferten den Beweis, dass eine prädiktive Gensignatur unabhängig in Osteosarkomdaten von Hunden gefunden werden konnte und darüber hinaus in vergleichbaren Osteosarkomdaten von Menschen gleichermaßen prädiktiv war. Dies motivierte uns zu der Frage, ob wir erstens unabhängige prädiktive Signaturen direkt aus dem DOG2-Datensatz ableiten könnten, die auf den TARGET-Datensatz angewendet werden könnten, und zweitens, ob diese Signaturen GS-1/GS-2 übertreffen könnten, insbesondere im Nicht-DOG2-Datensatz. metastatische TARGET-Kohorte. Die vergleichende Analyse der DOG2-Hundedaten, die vollständig von Hundepatienten stammen, die zum Zeitpunkt der Diagnose keine makroskopischen Metastasen aufwiesen, weist den engsten klinischen Zusammenhang auf und hat die größte translationale Relevanz für die in TARGET dargestellten nicht metastasierten menschlichen Patienten. Darüber hinaus ist dies die Patientenpopulation, für die eine therapeutische Stratifizierung und zusätzliche prognostische Biomarker erforderlich sind, um über den durch neoadjuvante Chemotherapie induzierten Prozentsatz der Nekrose beim Menschen hinaus zu verbessern, wodurch nicht alle Patienten mit hohem Risiko für metastatische Progression zuverlässig identifiziert werden können36,37,38 Einzelproben-Gensatz Die Anreicherungsanalyse unter Verwendung der 52 charakteristischen Gensätze aus der mSigDB auf DOG2, gefolgt von k-Means-Clustering, identifizierte zwei unterschiedliche Cluster (Abb. 1b). Die Kaplan-Meier-Analyse ergab Kurven für jeden Cluster mit signifikant unterschiedlichem DFI und OSv (ergänzende Abbildung 8a, b) für diese Hundepatienten. Die Analyse der differentiellen Genexpression zwischen den beiden Gruppen identifizierte 259 unterschiedlich exprimierte Gene. Interessanterweise überlappten 19 dieser Gene mit GS-1 und 61 mit GS-2, was erneut die Relevanz dieser zuvor identifizierten Signaturen im DOG2-Datensatz unterstreicht. Darüber hinaus ergab die IPA-Analyse der DEGs 45 signifikante Signalwege (ergänzende Abbildung 8c). Davon stehen 22 Signalwege im Zusammenhang mit Entzündungen oder Immunfunktionen und 36 überschneiden sich mit der IPA-Analyse von DEGs, die mit GS-1 assoziiert sind. Die große Überlappung der Signalwege ist nicht überraschend, da 173 Gene auch in der DEG-Analyse zwischen FP- und PP-Gruppen enthalten sind, was das zugrunde liegende immunfokussierte Thema in den DOG2-Daten unterstreicht, das mit der Prognose verbunden ist.

Angesichts der Tatsache, dass 259 Gene aus unseren Signaturen, darunter die in GS-1 und GS-2, mehrere Immunprozesse umfassen, versuchten wir, granulare Teilmengen von Genen und Proben in den Daten zu identifizieren, indem wir Bi-Clustering unter Verwendung eines iterativen Suchalgorithmus (ISA, Ansatz) einsetzten in Abb. 1b dargestellt). Der ISA-Algorithmus ergab 4 Bi-Cluster mit insgesamt 103 Genen (ISA 1: 30, ISA 2: 19, ISA 3: 39, ISA 4: 15) (Ergänzungstabelle 3). Während für jeden Bi-Cluster über die vier von ISA abgeleiteten Gensignaturen leicht ein eindeutiges Überexpressionsmuster beobachtet werden kann (Abb. 7a – d), ergab nur ISA-Proben-Bi-Cluster 4 einen signifikanten Unterschied im DFI bei Hunden nach Kaplan-Meier Analyse (Abb. 7h). Obwohl das strikte Signifikanzkriterium p < 0,05 nicht erfüllt ist, zeigt der ISA-Proben-Bi-Cluster 3 darüber hinaus einen deutlichen Unterschied im DFI zu früheren Zeitpunkten, was zu einem 14-wöchigen Unterschied im mittleren Überleben führt (Abb. 7g). Angesichts des schnellen Fortschreitens zu makroskopischen Metastasen, die bei Hunden häufig innerhalb der ersten 6 Monate nach der Diagnose bei der aktuellen Standardversorgung auftreten, könnte dies für Tierärzte von erheblicher klinischer Bedeutung sein.

DOG2-Genexpressionsprofile für (a) ISA-Signatur 1, (b) ISA-Signatur 2, (c) ISA-Signatur 3 und (d) ISA-Signatur 4. Entsprechende Kaplan-Meier-Kurven des ISA-Probenbiclusters im Vergleich zu allen anderen Proben für ISA-Signatur 1 (e), ISA-Beispielbicluster 2 (f), ISA-Signatur 3 (g), ISA-Signatur 4 (h). Die Y-Achse stellt das Gesamtüberleben dar, wobei die Medianwerte in Tagen ab der Diagnose angegeben werden.

Wir wollten weiter feststellen, ob diese neuen Signaturen irgendeine Relevanz in den TARGET-Daten und insbesondere in der nicht-metastasierten Kohorte haben, die den menschlichen OS-Patienten, die DOG2 umfassen, am nächsten mit den OS-Patienten bei Hunden vergleichbar ist. Wir haben eine ähnliche Strategie wie bei den GS-1- und GS-2-Signaturen angewendet und K-Means-Clustering verwendet, um die Proben basierend auf den Genexpressionsdaten zu gruppieren. Basierend auf dieser Clusterbildung wurde eine Kaplan-Meier-Analyse zwischen den Clustern durchgeführt, um festzustellen, ob die gegebene Gensignatur mit einem signifikanten Unterschied in den Patientenergebnissen verbunden war. Drei der Signaturen erzeugten zwei unterschiedliche Cluster: ISA-Gensignatur 1, ISA-Gensignatur 2 und ISA-Gensignatur 3 sowohl im gesamten TARGET-Datensatz (Abb. 8) als auch in der nicht metastasierten TARGET-Patientenuntergruppe (Abb. 9). Interessanterweise war die ISA-Gensignatur 1, obwohl sie bei Hunden keinen prognostischen Wert zeigte, in den TARGET-Daten prognostisch für das progressionsfreie Überleben, insbesondere nur bei nicht metastasierten Patienten (Abb. 9d). Ebenso war die ISA-Signatur 3 sowohl im gesamten TARGET-Datensatz (Abb. 8f) als auch bei nicht metastasierten Patienten (Abb. 9f) signifikant prognostisch. ISA-Gensignatur 4 erzeugte instabile Cluster, die Cluster und die Unterschiede zwischen Kaplan-Meier-Kurven würden sich aufgrund der inhärenten stochastischen Natur des K-Means-Algorithmus drastisch ändern. Die Cox-Regressionsanalyse der Gene in der ISA-Signatur 4 ergab jedoch, dass die Irokesen-Homöobox 1 (IRX1) eine Prognose für das progressionsfreie Überleben darstellte, wobei eine höhere Expression letztendlich zu schlechten Ergebnissen führte (ergänzende Abbildung 9a), worüber bereits bei einem nicht verwandten menschlichen Betriebssystem berichtet wurde Datensatz sowie Vorhersage von Lungenmetastasen in Mausmodellen39. Dieses Verhalten spiegelt sich beim Hund wider (ergänzende Abbildung 9b).

TARGET-Genexpressionsprofile für (a) ISA-Gensignatur 1, (b) ISA-Gensignatur 2 und (c) ISA-Signatur 3. Entsprechende Kaplan-Kurven für aus (d) gebildete K-Means-Cluster. ISA-Gensignatur 1, (e) ISA-Gensignatur 2 und (f) ISA-Gensignatur 3. *ISA-Gensignatur 4 wurde weggelassen, da sie keine konsistenten Cluster bildete. Die Y-Achse ist das progressionsfreie Überleben. Die Medianwerte werden in Tagen ab der Diagnose angegeben.

TARGET-Genexpressionsprofile (nicht metastasierte Patienten) für (a) ISA-Gensignatur 1, (b) ISA-Gensignatur 2 und (c) ISA-Signatur 3. Entsprechende Kaplan-Kurven für K-Means-Cluster, die aus (d) ISA gebildet wurden Gensignatur 1, (e) ISA-Gensignatur 2 und (f) ISA-Gensignatur 3. *ISA-Gensignatur 4 wurde weggelassen, da sie keine konsistenten Cluster bildete. Die Y-Achse ist das progressionsfreie Überleben. Die Medianwerte werden in Tagen ab der Diagnose angegeben.

Eine wesentliche Frage dieser Analyse ist, ob diese Signaturen eine biologische Bedeutung haben, die auf Unterschiede zwischen den verschiedenen Populationen von Patienten und/oder Tumorzellen und den damit verbundenen Mikroumgebungen hinweist. Die ISA-Gensignatur 3 war am stärksten mit Immunprozessen verbunden, einschließlich T-Zell-Bindung und -Reaktion (CD2, CD3E, CD6, CXCR6, CLEC2D40, GZMB), Interferon-Gamma-Reaktion (CLEC2D41, GBP1, GBP5), natürlichen Killerzellen (CLEC2D40, GZMB, GZMK) und IL2RB und IL2RG, die an vielen Prozessen beteiligt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, IL-2-Signalisierung, IL-15-Signalisierung und IL-9-Signalisierung. Mehrere Gene in der ISA-Gensignatur 1 beziehen sich auf die Motilität von Neutrophilen (LSP142, CXCL1443, SELP44), die Regulierung dendritischer Zellen (ACKR245, TMEM167A46, CXCL1447), die Regulierung von Makrophagen (ACKR245, CFH48), die Hemmung der Tumorzellmigration (SEMA3G49) und Lungentumor Suppressor (GPRC5A50). Obwohl die ISA-Gensignatur 2 nicht prognostisch ist, zeigte sie deutlich Expressionsmuster, die sowohl bei Menschen als auch bei Hunden beobachtet werden konnten. Darüber hinaus wurden viele Gene in der ISA-Gensignatur 2 mit dem DMD-Gen in Mäusen in Verbindung gebracht, darunter MYL1 und MYH251, DES52, MYBPC1, MYH1, TMOD4, PYGM und PDK453. Dies könnte in demselben Manuskript, aus dem GS-1 und GS-2 abgeleitet wurden, von besonderer Bedeutung sein. In dieser Arbeit haben Gardner et al. identifizierten Mutationen in Dystrophin (DMD) bei 2 der 24 von WGS21 analysierten Hunde. Die ISA-Gensignatur 4 weist nicht unbedingt ein besonders zusammenhängendes Thema auf, obwohl sie die größte Signatur ist. Es enthält zwei Kollagengene (COL11A2, COL2A1), mehrere Trägergene für gelöste Stoffe (SLC8A3, SLC13A5, SLC36A2), die nachweislich bei Osteosarkomen prognostisch sind54, und Gene, die an der Wnt-Signalisierung beteiligt sind (APCDD1L, BARX1), die angesichts der onkogenen Rolle von Bedeutung sein könnten Wnt-Signale spielen beim Osteosarkom eine Rolle55,56.

Die 5-Jahres-Überlebensrate für Menschen mit lokalisiertem OS stagniert bei etwa 70 %, was den Bedarf an aussagekräftigen Tiermodellen unterstreicht, die bei neuartigen therapeutischen Entdeckungs- und Entwicklungsbemühungen helfen1,2,3,57,58. Gleichermaßen trotz des Einsatzes multimodaler Therapie Die Prognose für das OS bei Hunden ist durchweg schlecht, mit einer mittleren Überlebenszeit von 5 bis 13 Monaten für Patienten mit lokalisierter Erkrankung59,60. Einige dieser Hunde werden in klinische Studien aufgenommen, die darauf abzielen, die Ergebnisse bei OS-Patienten bei Hunden und Menschen zu verbessern. Eine der größten Herausforderungen beim OS besteht, wie bei den meisten Krebsarten, darin, festzustellen, ob die Behandlung und das Ergebnis durch die Identifizierung von Teilpopulationen von Patienten mit unterschiedlicher zugrunde liegender Tumorbiologie und potenzieller einzigartiger Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Therapien beeinflusst werden können. Frühere Studien haben prognostische Faktoren wie den histologischen Subtyp61, den histologischen Grad62, die Tumorlokalisation63 und die alkalischen Phosphatasespiegel im Serum hervorgehoben62,64.

Hier zeigen wir, dass Transkriptionssignaturen, die vollständig aus Hunde-Osteosarkomen stammen und sowohl zuvor berichtete als auch de novo durch einen ssGSEA- und ISA-Ansatz definiert wurden, sowohl Hunde- als auch Menschendaten in zwei unterschiedliche Populationen aufteilen. Wenn alle TARGET-Daten berücksichtigt werden, hängen sowohl das progressionsfreie Überleben als auch das Gesamtüberleben signifikant mit der durch diese Gensignaturen bestimmten Clusterzuordnung zusammen. Das Vorliegen einer metastatischen Erkrankung stellt jedoch jegliche Vorhersagefähigkeit für eine der hier verwendeten Gensignaturen in den Schatten. Dies ist angesichts der düsteren Prognose für fortgeschrittene Krankheitsstadien und der Therapierefraktärität makroskopischer Metastasen nicht überraschend. Die größere Stichprobengröße und die Einheitlichkeit der DOG2-Kohorte könnten im Vergleich zu TARGET, das menschliche Patienten umfasst, die wahrscheinlich einer viel größeren Vielfalt an Therapien und nicht standardisierten Krankheitsüberwachungsprotokollen unterzogen wurden, auch die prädiktive Signaturerkennung verbessern. Unter dem Gesichtspunkt der Überlebensanalysen macht die Frage der humanen Euthanasie bei Hunden jedoch die Beurteilung und vergleichende Bewertung des Gesamtüberlebens zwischen Hunden und Menschen problematisch, da die Besitzer entscheiden müssen, ob sie eine zusätzliche Therapie statt einer Euthanasie durchführen, wenn sie mit dem Fortschreiten der Krankheit ihres Hundes konfrontiert sind Krankheit. Eine Möglichkeit, die Übersetzung klinischer Studien an Hunden zu verbessern, besteht darin, das krankheitsfreie Intervall (DFI) als primären klinischen Endpunkt zu bewerten, was einen unschätzbaren Aspekt des DOG2-Datensatzes darstellt. Wie bereits erwähnt, ist das Fortschreiten der Metastasierung für beide Arten von entscheidender Bedeutung, da die Entwicklung von Metastasen nach wie vor der wichtigste Prognosefaktor bei Menschen und Hunden ist.

Wenn wir DOG2 als Verteilungsmodell verwenden, würde basierend auf der Anzahl menschlicher Metastasenproben im TARGET-Datensatz (n = 20) die erwartete Anzahl in der FP-Gruppe 6,3 und die erwartete Anzahl in der PP-Gruppe 13,7 betragen. Vergleicht man dies mit den tatsächlichen Werten von GS-1 von 5 und 15, würde dies eine ähnliche Verteilung der Patienten in den FP- und PP-Gruppen ergeben, wie durch einen Chi-Quadrat-Anpassungstest getestet (χ2 = 0,391, p = 0,531). Insgesamt liefert diese Analyse Hinweise darauf, dass es eine Population menschlicher Betriebssysteme gibt, bei denen diese Gensignaturen wie bei Hunden prognostisch sein könnten. Darüber hinaus sind die Transkriptionsprofile sowohl in den DOG2- als auch in den TARGET-Daten konserviert, was stark auf eine zugrunde liegende gemeinsame Biologie schließen lässt. Der vergleichende Ansatz bietet erhebliche Vorteile für die Entdeckung prädiktiver Faktoren, die auf das OS anwendbar sein können, unterstützt durch die Häufigkeit der Krankheit in der Haushundpopulation, die hohe Metastasierungsrate und die Möglichkeit, groß angelegte klinische OS-Studien bei Hunden durchzuführen mit gleichzeitiger Entnahme biologischer Proben65. Wenn eine größere Kohorte prospektiv gesammelter menschlicher Daten mit harmonisierten Behandlungs- und Nachsorgemaßnahmen verfügbar wäre, beispielsweise aus einer klinischen Studie wie in der DOG2-Kohorte, könnte der Ansatz hier eine größere Vorhersagekraft für Menschen haben. Allerdings müssen in diesem Zusammenhang auch die inhärente Heterogenität der Erkrankung und die Unterschiede zwischen der Tumorbiologie von Hund und Mensch berücksichtigt werden.

Zusätzliche Transkriptionsanalysen wie GSEA, CIBERSORTx und differenzielle Expression, unterstützt durch immunhistochemische Analysen in DOG2, legen sowohl in DOG2 als auch in TARGET die Bedeutung von Immunprozessen und Immunzellen für den Krankheitsverlauf und -ausgang nahe. GSEA zeigte in der FP-Gruppe eine Anreicherung mehrerer Signalwege, die an der angeborenen Immunität und Entzündung beteiligt sind, wie z. B. die Interferonreaktion und das Komplementsystem. Dies wird durch die Arbeit von Scott et al. gestützt. und Wan et al. die zuvor gezeigt haben, dass eine immunbasierte Gensignatur zu einer besseren Prognose beim Menschen führt66,67. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse nach mithilfe von CIBERSORTx ermittelten Schätzungen darauf hin, dass Unterschiede in der Makrophagen-, Plasmazellen- und T-Zellpopulation möglicherweise das Fortschreiten der Krankheit und das Überleben sowohl beim OS von Hunden als auch von Menschen beeinflussen. Allerdings wurde in B-Zellpopulationen ein bemerkenswerter Unterschied zwischen DOG2 und TARGET beobachtet, nämlich ein durch Immunhistochemie unterstützter Anstieg der B-Zellen in der FP-Gruppe von DOG2, der in TARGET nicht beobachtet wurde.

Obwohl Rechenalgorithmen wie CIBERSORT und CIBERSORTx in Hundestudien25,68,69 verwendet wurden, ist es wichtig zu beachten, dass diese Algorithmen größtenteils in Bezug auf menschliche Daten entwickelt und getestet wurden, um mRNAseq-Massendaten in relative Darstellungen von Zellpopulationen zu entfalten. Obwohl Hunde- und menschliche Zellen in Bezug auf zelluläre Marker sehr vergleichbar sind, gibt es einige Unterschiede, wie z. B. die CD4-Positivität von Hunde-Neutrophilen, die eine solche rechnerische Analyse beeinflussen könnten70,71. Bisher schätzte CIBERSORTx einen hohen Anteil an Mastzellen in unserem Hunde-Osteosarkom-Gewebe. Allerdings konnten wir das Vorhandensein von Mastzellen nicht mit Toluidinblau bestätigen (ergänzende Abbildung 10), einer histochemischen Färbetechnik, die in anderen Studien zur Quantifizierung von Mastzellen in entkalkten Knochenläsionen verwendet wurde72,73,74,75. Interessanterweise wurden Mastzellen in menschlichen OS-Proben76 beschrieben und machten einen erheblichen Anteil der Zellen in unseren CIBERSORTx-Ergebnissen aus menschlichen TARGET-Daten aus (4,5 %, der vierthäufigste Zelltyp). Osteosarkome sind heterogene Tumoren, daher können regionale Unterschiede im Tumorgewebe, das für RNAseq und den FFPE-Block eingereicht wird, auftreten; Dennoch deuten unsere Daten darauf hin, dass weitere Arbeiten erforderlich sind, um die mögliche Rolle von Mastzellen im Zusammenhang mit Osteosarkomen abzugrenzen und zu validieren, wie sich die Kombination der LM22-Signatur und des CIBERSORTx-Algorithmus speziell bei Osteosarkomen des Hundes verhält, die sich parallel zu einer natürlichen Co-Evolution entwickeln Immun-Mikroumgebung.

Der Charakter und die Robustheit der Immunzellantwort spielen bekanntermaßen eine entscheidende Rolle bei Krebserkrankungen bei Hunden. Beispielsweise wird berichtet, dass Hunde mit OS deutlich weniger zirkulierende Tregs haben, während ein verringertes CD8+/Treg-Verhältnis mit einer schlechten Überlebensrate verbunden ist77. Ebenso wurden beim menschlichen OS höhere Konzentrationen an CD8+-T-Zellen mit besseren Ergebnissen in Verbindung gebracht78,79,80 und sind Gegenstand neuer Immuntherapien81. Darüber hinaus war in einer immunhistochemischen Analyse von 30 OS-Tumoren bei Hunden eine höhere Anzahl CD204-positiver Zellen mit einem deutlich längeren DFI82 verbunden. Darüber hinaus haben Das et al. berichteten, dass 22 immunbezogene Gensätze bei Hunden mit längeren DFIs in einem kleinen Stichprobensatz von 26 Hunden angereichert wurden25. Diese und die vorliegende Studie unterstreichen die Bedeutung der Immunantwort für das Fortschreiten des Krebses.

Die Mikroumgebung des Tumors beherbergt mehrere zusammenarbeitende Immunzellen, darunter die tumorassoziierten Makrophagen (TAMs), die im Zusammenhang mit OS83,84 besonderes Interesse geweckt haben. Die von uns präsentierten Daten deuten zweifellos auf die Makrophagenbiologie hin, die sowohl bei OS-Tumoren bei Hunden als auch bei Menschen gemeinsam ist. Im Hinblick auf die CIBERSORT-Analyse machen beispielsweise M0- und M2-Makrophagen sowohl in DOG2 als auch in TARGET einen erheblichen Anteil der Zellpopulation aus. Sie folgen auch dem gleichen Muster, bei dem M2-Makrophagen in der FP-Gruppe häufiger vorkommen und mehr M0-Makrophagen in der PP-Gruppe zu sehen sind. Darüber hinaus ist der Anteil der M1-Makrophagen in der FP-Gruppe viel größer, obwohl sie in einem viel kleineren Anteil vorhanden sind: 13x für DOG2 und 3x für TARGET. Es wird angenommen, dass M1-Makrophagen neben der Eliminierung von Tumorzellen durch Phagozytose auch die Zytotoxizität anderer Leukozyten stimulieren und verstärken, indem sie die Präsentation von Tumorantigenen und die Förderung entzündungsfördernder Zytokine steigern85,86. Alternativ sind M2-Makrophagen mit Immunsuppression, verminderter Antigenpräsentation, Wachstumsfaktorfreisetzung und Förderung der Angiogenese verbunden; von allen wird angenommen, dass sie das Fortschreiten von Krebs begünstigen86,87. Beim OS gibt es jedoch gemischte Belege dafür, wie TAMs die Gesamtergebnisse der Patienten beeinflussen. Ein Großteil der Literatur zum Zusammenhang zwischen TAMs und OS deutet auf einen Zusammenhang zwischen der gesamten Makrophageninfiltration, bestehend aus M1- und M2-Phänotypen, und einem verlängerten progressionsfreien Intervall oder Gesamtüberleben hin. Deng et al. verwendeten den CIBERSORT-Algorithmus, um ein besseres Gesamtüberleben bei erhöhter M1- und M2-Makrophageninfiltration zu zeigen. In ähnlicher Weise haben Buddingh et al. mithilfe von genomischem Profiling und IHC festgestellt, dass In einer Kohorte von 63 Patienten wurde festgestellt, dass die gesamte TAM, sowohl M1- als auch M2-Phänotyp, mit einem besseren Ergebnis verbunden war88. Eine zusätzliche Studie, die CD163 zur Quantifizierung von TAM in 124 menschlichen OS-Tumoren verwendete, ergab, dass erhöhte TAMs zu einem längeren progressionsfreien Überleben und Gesamtüberleben führten89, was durch eine ähnliche Hundestudie ergänzt wird, die über längere DFIs mit erhöhten TAMs82 berichtete.

Unsere transkriptomische Analyse zeigt, dass M2-Makrophagen im Hunde-OS reichlich vorhanden sind, wobei der IHC-Nachweis zahlreiche Makrophagen exprimiert, die CD204 exprimieren, einen Makrophagen-Scavenger-Rezeptor, der in M2-Makrophagen beim Menschen stark exprimiert wird90. M2-Makrophagen wurden mit schlechten Ergebnissen bei mehreren anderen Tumortypen in Verbindung gebracht91,92,93; DOG2-Daten deuten jedoch darauf hin, dass eine größere Anzahl von M2-Makrophagen von Vorteil sein könnte. Die Antwort könnte eindeutig auf den Knochen selbst zurückzuführen sein, in dem sowohl Makrophagen als auch Osteoklasten von Monozyten abgeleitet sind, während IL-4 und IL-13, die für die Differenzierung eines Monozyten in M2-Makrophagen benötigt werden, Inhibitoren der Osteoklastenbildung sind94. Daher ist es möglich, dass eine Verschiebung der Monozytendifferenzierung zugunsten von M2-Makrophagen die Osteoklastenbildung verringert und dadurch die Knochenresorption hemmt, die für die Tumorentwicklung von wesentlicher Bedeutung sein könnte. Darüber hinaus sind M2-Makrophagen bekannt oder produzieren eine Reihe von Zytokinen, die Osteoklasten aktiv regulieren, darunter IL-10, BMP-2, TGF-β1, OPN und 1,25-Dihydroxyvitamin D395. Es gibt Hinweise darauf, dass die Hemmung der Osteoklastenbildung das lokale Tumorwachstum verringert und die Überlebensrate erhöht. Beispielsweise haben Lamoureux et al. zeigten in einem Nagetiermodell, dass erhöhtes Osteoprotegrin (OPG), das auch die Osteoklastenbildung hemmt, zu einem verringerten lokalen Tumorwachstum und einer vierfachen Steigerung der Überlebensrate der Mäuse führte96. Darüber hinaus haben Ohba et al. stellten fest, dass das Osteosarkomwachstum direkt mit der tumorinduzierten Osteolyse und der Aktivierung von Osteoklasten in vivo korreliert97. Darüber hinaus trat die hohe Häufigkeit von CD204-positiven Makrophagen gleichzeitig mit einer erhöhten B- und T-Zell-Tumorinfiltration auf, was darauf hindeuten könnte, dass eine höhere Panimmunzellantwort mit einer verbesserten Prognose einhergeht, unabhängig vom Makrophagen-Subtyp. Die Bedeutung einer wirksamen Immunantwort wird auch durch die relative Häufigkeit von Immunzelltypen bei Hunde-OS gestützt, nämlich dass drei der vier Zelltypen mit höherer relativer Häufigkeit in der PP-Gruppe (GS-1-Signatur) naiv oder nicht aktiviert sind (naive B-Zellen, naive CD4 T, M0-Makrophagen), was auf eine unzureichende Antitumor-Immunantwort hinweisen kann.

Wir haben gezeigt, dass viele der von Gardner et al. können mithilfe von ssGSEA und ISA-basiertem Bi-Clustering unabhängig direkt aus DOG2-Daten abgeleitet werden, und diese Gene spiegeln einen Unterschied in den Immunprozessen zwischen zwei unterschiedlichen Patientenpopulationen wider. Da wir den Unterschied zwischen den Gruppen jedoch im Allgemeinen als „immun heiß“ und „immun kalt“ charakterisieren, spiegelt diese Dichotomie das Spektrum der Patientenproben nur unvollständig wider. Die Verwendung verschiedener Clustering-Methoden führte zu vier neuen Gensignaturen, deren Grundlagen auf relevante biologische Unterschiede schließen lassen. Bemerkenswert ist, dass im Gegensatz zu Gardners Signaturen zwei der Signaturen in den TARGET-Daten der nicht metastasierten Kohorte prognostisch waren. Allerdings waren diese Signaturen in den DOG2-Daten nicht signifikant prognostisch. Dies lässt sich möglicherweise am besten mit dem ISA-Bi-Cluster und der Gensignatur 3 in Einklang bringen, die eine deutliche Abweichung zu frühen Zeitpunkten in den DOG2-Daten zeigt, was die Fähigkeit von Gensignaturen zeigt, Krankheitsprogression mit frühem Metastasierungsversagen bei OS des Hundes zu erkennen. Wenn man bedenkt, dass die ISA-Gensignatur 4 aus mehreren Genen besteht, die mit T-Zell-Prozessen in Zusammenhang stehen, ist es möglich, dass Patienten mit dieser Signatur eine Anti-Tumor-Immunantwort auslösen können, aber mit der Zeit werden Prozesse wie die T-Zell-Erschöpfung dominanter . Die Analyse von Längsschnittdatensätzen desselben Patienten könnte diese Hypothese stützen. Die Abhängigkeit von T-Zellen könnte erklären, warum diese Signatur in nicht metastasierten TARGET-Proben besser abschneidet als GS-1 oder GS-2, da eine höhere T-Zell-Aktivität die Entwicklung von Metastasen verhindern könnte. Auch wenn die ISA-Gensignatur 2 nicht über die prognostische Kapazität verfügt, weist sie doch auf eine mögliche gemeinsame Population mit DMD-Mutationen beim menschlichen OS und beim Hunde-OS hin, die durch vergleichende Analyse übereinstimmender Datensätze zur Gesamtgenomsequenzierung untersucht wird. In Bezug auf die ISA-Gensignatur 4 zeigen wir Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen39, dass eine Überexpression von IRX1 sowohl bei Menschen als auch bei Hunden zu einer schlechten Prognose führt. Die ISA-Gensignatur 1 wurde von unseren Hundepatienten abgeleitet und identifizierte ein ähnliches Expressionsmuster sowohl in den Hunde- als auch in den menschlichen Datensätzen; Während es jedoch beim menschlichen OS prognostisch ist, ist dies bei Hunden nicht der Fall. Dies untermauert das Potenzial, dass von Tumoren von Hunden abgeleitete Signaturen klinische Relevanz für menschliche Patienten erlangen. Das Fehlen einer prognostischen Signifikanz in unseren Hundeproben spiegelt möglicherweise den Grad der genomischen und transkriptomischen Komplexität der Krankheit oder den unterschiedlichen Behandlungsansatz bei Hunden und Menschen wider, der die Fähigkeit zur Identifizierung von Gensignaturen mit prognostischer Kapazität bei beiden Arten beeinflussen kann. Beispielsweise wurden Hundepatienten, aus denen die DOG2-Kohorte besteht, einer Gliedmaßenamputation und bis zu vier Zyklen einer Carboplatin-Chemotherapie unterzogen, wobei nur sehr wenige Hunde nach der Erkennung einer Metastasenprogression einer zusätzlichen Behandlung unterzogen wurden. Dies steht im krassen Gegensatz zu Menschen mit OS, die sich häufig einer chirurgischen Metastasektomie sowie wiederholten Salvage-Chemotherapie-Runden unterziehen, wenn die Krankheit fortschreitet. Darüber hinaus ist Euthanasie die häufigste Todesursache bei Hunden und spiegelt oft eher den Willen des Besitzers als das Ausmaß der Krankheit wider. Dies kann durch eine kürzere Lebensdauer noch verstärkt werden, die die Identifizierung signifikanter Unterschiede im OS zwischen Populationen ausschließen kann. Aus diesen Gründen sollte im Kontext der vergleichenden Onkologie der Schwerpunkt auf die Identifizierung von Faktoren gelegt werden, die eher einen prädiktiven Wert für krankheitsfreie Intervalle als für das Gesamtüberleben haben.

In dieser Studie haben wir den Nachweis erbracht, dass deutliche Unterschiede in den Immunzellpopulationen zu signifikanten Unterschieden in den Ergebnissen bei OS-Patienten bei Hunden führen. Indem wir dieselbe Analyse auf den mRNA-Seq-Teil des TARGET-Datensatzes anwendeten, konnten wir überzeugende Beweise dafür liefern, dass diese transkriptomischen und klinischen Muster, die bei OS-Patienten bei Hunden identifiziert wurden, vergleichbar auf das OS beim Menschen angewendet werden können. Weitere Analysen ergaben bei beiden Arten gemeinsame zelluläre Prozesse, was auf ein Transkriptionsprogramm hindeutet, das ein reichhaltiges Zusammenspiel zwischen Tumorzellen und Immunzellen in der Tumormikroumgebung aufweist. Dies bietet ein Sprungbrett für weitere Untersuchungen der vergleichenden Einzelkern-Transkriptomik und der raumbezogenen Transkriptionsprofilierung. Darüber hinaus untermauern Hinweise auf gemeinsame zelluläre Prozesse und die damit verbundene Biologie zwischen OS-Primärtumoren bei Hunden und Menschen den Wert des Hundes als Patientenmodell für das OS beim Menschen und bieten Möglichkeiten, diese Signalwege als medikamentöse Ziele bei beiden Arten zu erforschen. Darüber hinaus wird der Hundepatient als präklinisches OS-Modell durch die höhere jährliche Inzidenz von OS bei Hunden im Vergleich zu Menschen gestützt. Aus rein rechnerischer Sicht könnte die größere Menge und Verfügbarkeit von Hunde-Omics-Daten es Computerwissenschaftlern ermöglichen, neue therapeutische Ziele und Behandlungsstrategien zu entdecken, die dann direkt auf das menschliche OS angewendet werden könnten. Klinische Studien an Hunden und die wertvollen Daten, die sie liefern, werden für Forscher und Kliniker sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Medizin von großem Nutzen sein, indem sie unser Verständnis der Krankheit verbessern und die Entwicklung wirksamer Behandlungen vorantreiben. Eine solche grundlegende Grundlagenarbeit ist ein wesentlicher Aspekt bei der Bestimmung, wie zukünftige onkologische klinische Studien, die an Haushunden durchgeführt werden, am besten genutzt werden können, um menschlichen OS-Patienten zu helfen.

Demografische und klinische Ergebnisdaten, einschließlich der Demografie von Hundepatienten, der Tumorlokalisation und dem Status der alkalischen Phosphatase (ALP) im Serum, wurden aus den Patientenkohorten klinischer Hundestudien kuratiert, die in den klinischen Studien 021/022 des Comparative Oncology Trials Consortium (COTC) 021/022 des National Cancer Institute registriert waren65 . (Ergänzungstabellen 4, 5). In den teilnehmenden veterinärmedizinischen akademischen Einrichtungen des COTC wurden Privathunde unterschiedlichen Alters, Rasse und Geschlechts eingeschrieben, wobei jede Einrichtung ihr eigenes institutionelles Protokoll zur Tierpflege und -nutzung für die klinische Studie einhielt, das einheitliche Versuchsverfahren enthielt ein harmonisierter klinischer Pflege-/Überwachungsplan. Diese Kohorte von Hundepatienten wird im Folgenden als DOG2 (Decoding the Osteosarcoma Genome of the Dog) bezeichnet und besteht aus 324 Hunden65. Alle Tumorbiopsien wurden vor der Behandlung entnommen und von anatomischen Veterinärpathologen an teilnehmenden COTC-Einrichtungen ausgewertet (https://ccr.cancer.gov/comparative-oncology-program/consortium). Nach der QA/QC der Tumorproben und der Durchsicht der Krankenakten wurden 186 Primärtumoren zur Analyse weitergeleitet. Alle Hunde hatten eine bestätigte Diagnose eines appendikulären Osteosarkoms und keine Anzeichen einer makroskopischen metastatischen Erkrankung, basierend auf Standard-Stadieneinteilungsmethoden und keiner vorherigen Behandlung. Bei allen Hunden wurde die betroffene Extremität amputiert und anschließend in einen von zwei Behandlungsarmen randomisiert: (1) adjuvantes Carboplatin allein (n = 93; Standardbehandlung/SOC) oder (2) adjuvantes Carboplatin plus Rapamycin (N = 93; SOC +). Rapamycin). Signifikante Unterschiede im Ergebnis zwischen den beiden verschiedenen Behandlungsarmen wurden nicht beobachtet (ergänzende Abbildung 11). Der Zugriff auf den TARGET-Datensatz erfolgte über das National Cancer Institute Genomic Data Commons unter https://portal.gdc.cancer.gov/98. Insgesamt wurden 88 RNA-SEQ-Dateien heruntergeladen und in einer einzigen Datenmatrix zusammengestellt. Für 85 von 88 Proben lagen entsprechende klinische Daten vor. Die RNA-seq-Daten von 6 Proben wurden ausgeschlossen, da sie einen Bruchteil des Exons und kodierende Basen von weniger als 0,5 und eine intergenische Rate größer oder gleich 0,3 aufwiesen, sodass RNA-seq-Daten von 79 menschlichen Proben für die nachgelagerte Analyse geeignet blieben.

RNA wurde aus gefrorenem Tumorgewebe von Hunden in RNAlater mit dem Qiagen Allprep DNA/RNA Mini Kit (Kat.-Nr. 80204) isoliert. Die Qualität und Quantität der gesamten RNA wurde mit Nanodrop 8000 (Thermofisher) und Agilent 4200 Tapestation mit RNA Screen Tape (Kat.-Nr. 5067-5576) und RNA Screen Tape-Probenpuffer (Kat.-Nr. 5067-5577) bewertet. Alle zur mRNA-Sequenzierung weitergeleiteten Proben hatten einen RIN > 8 und eine Gesamt-RNA-Menge > 100 ng.

Als Input für die RNA-Sequenzierungsbibliotheken wurden zwischen 100 ng und 1 ug Gesamt-RNA verwendet. Bibliotheken wurden mit dem TruSeq Stranded mRNA Library Kit (Illumina) gemäß dem Protokoll des Herstellers erstellt. Die Bibliotheken wurden gepoolt und auf NovaSeq S1 unter Verwendung eines 2 × 150-Zyklen-Kits sequenziert. Für die Verarbeitung von Rohdatendateien wurde die HiSeq Real Time Analysis-Software (RTA v.3.4.4) verwendet. Der Illumina bcl2fastq2.17 wurde zum Demultiplexen und Konvertieren binärer Basisaufrufe und -qualitäten in das schnelle Format verwendet. Die Proben hatten 44 bis 61 Millionen Pass-Filter-Lesevorgänge, wobei mehr als 91 % der Basen über dem Qualitätsfaktor von Q30 lagen. Die Messwerte der Proben wurden mithilfe von Cutadapt auf Adapter und minderwertige Basen zugeschnitten. Die getrimmten Lesevorgänge wurden mithilfe des STAR-Aligners (Version 2.7.0 f) mit Zwei-Pass-Alignment-Option auf das CanFam4-Referenzgenom (GSD_1.099 von NCBI) abgebildet. RSEM (Version 1.3.1) wurde zur Gen- und Transkriptquantifizierung basierend auf der CanFam4 GTF-Datei verwendet. Die durchschnittliche Kartierungsrate aller Proben betrug 83 %, mit einer eindeutigen Ausrichtung über 66 %. Es gab 13,13–26,26 % nicht zugeordnete Lesevorgänge. Die Kartierungsstatistiken wurden mit der Picard-Software berechnet. Die Proben hatten zwischen 0,01 und 0,76 % ribosomale Basen. Die prozentualen Kodierungsbasen lagen zwischen 58 und 71 %. Der Prozentsatz der UTR-Basen betrug 10–16 % und der mRNA-Basenanteil lag bei allen Proben zwischen 75–82 %. Die Komplexität der Bibliothek wurde anhand eindeutiger Fragmente in den zugeordneten Lesevorgängen mithilfe des Dienstprogramms MarkDuplicate von Picard gemessen. Die Proben hatten 48–78 % nicht-duplizierte Lesevorgänge. Darüber hinaus wurde die Quantifizierungsanalyse der Genexpression für alle Proben mit STAR/RSEM-Tools durchgeführt.

Für den DOG2-Datensatz wurde eine Filterung durchgeführt, um Gene mit geringer Anzahl mithilfe der R-Funktion filterByExpr des EdgeR-Pakets unter Verwendung der Parameter (min.count = 10, min.prop = 0,5, large.n = 5) zu entfernen, sodass 13408 von 37952 Sonden übrig blieben . Für den TARGET-Datensatz wurden Gene verwendet, die als proteinkodierendes oder polymorphes Pseudogen bezeichnet wurden, sodass insgesamt 20010 Gene übrig blieben. Jeder Datensatz wurde dann mithilfe der Quantilnormalisierung unter Verwendung des R-Pakets normalize.quantiles100 normalisiert. Die hier verwendeten Gensignaturen wurden aus einer differentiellen Expressionsanalyse zwischen OS-Tumoren des Hundes und einem Referenzosteoblasten des Hundes abgeleitet, wie in Gardner et al.21 beschrieben. Nach dem Filtern des DOG2-Datensatzes blieben 87 % (27 von 31) der Gene in der ersten Signatur (GS-1) und 58,1 % (157 von 270) der Gene in der zweiten Signatur (GS-2) übrig. In ähnlicher Weise wurden fast alle Gene in GS-1 und GS-2, die in DOG3 vorhanden sind, in TARGET konserviert, mit Ausnahme von zwei hundespezifischen Genen. Clustering-Analysen wurden mit Paketen durchgeführt, auf die über Python 3.8.3 zugegriffen werden kann. (Abb. 1a). K-Means-Clustering wurde mit Scikit-learn Version 0.23.1 durchgeführt. Die Clusterbildung erfolgte unabhängig von den damit verbundenen klinischen Ergebnissen. Die optimale Anzahl von Clustern in den Datensätzen wurde bestimmt, indem k von 2 bis 6 reichte und die Anzahl von Clustern mit dem maximalen Silhouette-Score101 ausgewählt wurde. Für jeden Cluster wurden Kaplan-Meier-Kurven erstellt und mit dem Survminer-Paket Version 0.4.9 und R Version 4.0.3 verglichen. Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA)102 wurde mit Version 4.1.0 durchgeführt. Verwendung molekularer Signaturen in der msigDB-Markenversion 7.533. Für die differenzielle Expressionsanalyse wurde die rohe Genexpression zunächst mit dem FilterByExpr-Paket unter Verwendung der Parameter (min.count = 10, min.prop = 0,5, large.n = 5) auf niedrige Zählungen gefiltert. Die Daten wurden dann unter Verwendung des getrimmten Mittelwerts von m normalisiert -values ​​(TMM)-Methode103 Differentialgene wurden dann mithilfe der Limma-Voom-Pipeline104 des EdgeR R-Pakets berechnet. Um die Pathway-Anreicherung zu bestimmen, wurden DEGs, die ein Cutoff-Kriterium einer Fold Change von mehr als 3 und einen angepassten p-Wert von weniger als 0,05 erfüllten, als Eingabe für die Qiagen Ingenuity Pathway Analysis (IPA)105 verwendet. Die Profilierung virtueller Immunzellen wurde mit dem CIBERSORTx-Algorithmus106, https://cibersortx.stanford.edu/index.php, an nicht logarithmisch transformierten TPM-Zähldaten unter Verwendung der LM22-Leukozyten-Gensignatur von Newman et al.107 durchgeführt. P-Werte für die CIBERSORTx-Ergebnisse wurden auf der Grundlage von 100 zufälligen Permutationen berechnet und Proben mit einem p-Wert größer als 0,05 wurden aus der weiteren Analyse entfernt. Die CIBERSORTx-Scores für jeden Zelltyp wurden zwischen Clustergruppen mithilfe eines Mann-Whitney-U-Tests ausgewertet.

Anschließend versuchten wir, neue Gensignaturen zu entwickeln, die über das hinausgehen, was zuvor in Gardner et al. beschrieben wurde. Die Single Sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA)108 wurde mit Version 10.1.0 unter Verwendung des Gene Pattern-Webservers wie folgt durchgeführt109 (Abb. 1b). Niedrige Genzahlen wurden mit filterByExpr (min.count = 10, min.prop = 0,5, groß. n = 5) gefiltert und mit (TMM)103 durch die calcNormFactors-Funktion im EdgeR-Paket und die transformierten Log 2-Zahlen pro Million Austritt normalisiert eine Datenmatrix mit 186 Proben und 13408 Sonden. Die wenigen Sonden, die demselben Gen zugeordnet waren, wurden gemittelt, während mehrere der nicht charakterisierten Sonden aufgrund von Unklarheiten in den Namenskonventionen entfernt wurden. Dies hinterließ eine endgültige Datenmatrix von 186 Proben von 13164 Genen. Unter Verwendung der typischen Gensignaturen33 in der mSigDB wurde ssGSEA durchgeführt, was zu einer transformierten Darstellung der Daten führte. Mit dieser transformierten Datenmatrix wurde K-Means-Clustering mit Scikit-learn Version 0.23.1 durchgeführt. Die optimale Anzahl von Clustern in den Datensätzen wurde bestimmt, indem k von 2 bis 6 reichte und die Anzahl von Clustern mit dem maximalen Silhouette-Score101 ausgewählt wurde. Basierend auf den im vorherigen Schritt gebildeten Clustern wurde eine DEG-Analyse mit der Limma-Voom-Pipeline104 des R-EdgeR-Pakets Version 3.32.1 durchgeführt. Bi-Clustering wurde an den DEGs unter Verwendung des iterativen Suchalgorithmus (ISA) durchgeführt. ISA erfordert die anfängliche Aussaat von Vektoren sowohl auf Genen als auch auf Proben. Diese Vektoren wurden generiert, indem zunächst ein hierarchisches Clustering mithilfe der hclust-Funktion in R durchgeführt wurde, wobei die Methode auf ward.D eingestellt war, was zu 10 Genclustern und 7 Probenclustern führte. Aus diesen Clustern wurden 3 Proben in jedem Cluster zufällig ausgewählt und zur Erstellung der Seeding-Vektoren verwendet. Da ISA stochastischer Natur ist, können die Ergebnisse je nach Seeding-Vektoren variieren. Daher haben wir den Algorithmus 25 Mal ausgeführt und nur Bi-Cluster, die in mehr als 75 % der Versuche auftraten, wurden als legitim angesehen (ergänzende Abbildung 12). Anschließend wurde eine Kaplan-Meier-Analyse zwischen jedem Bi-Cluster und den übrigen Proben durchgeführt. Um zu beurteilen, ob Bi-Cluster-Gensignaturen basierend auf den Hundedaten auf den menschlichen TARGET-Datensatz anwendbar sind, wurde K-Means-Clustering mit optimalem K im Bereich von 2 bis 6 durchgeführt, ausgewählt durch Auswahl des maximalen Silhouette-Scores und dann gefolgt von Kaplan– Meier-Analyse.

Alle Hundegewebe wurden mit 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert, mit 12 % EDTA mit einem pH-Wert von 7,2 entkalkt und anschließend in Paraffin eingebettet. Ein Antikörperpanel gegen spezifische Immunzellmarker (Ergänzungstabellen 1, 2) wurde verwendet, um eine Untergruppe von 20 Proben zu färben. Die Kennzeichnung von Hundegeweben für CD204 wurde vom Animal Health Diagnostic Center der Cornell University durchgeführt. Die IHC des verbleibenden Hundegewebes wurde vom Histology Laboratory an der University of Georgia, College of Veterinary Medicine, vervollständigt. Die immunhistochemische Markierung wurde mit einem Olympus CX43-Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung (hpf; 0,196 mm2) untersucht. Zellen, die Iba1 und CD204 exprimierten, waren zahlreich und wurden semiquantitativ mit 1+ (0–50/hpf), 2+ (51–100/hpf) oder 3+ (>100/hpf) bewertet. Zellen, die CD3, CD45RA, FOXP3, CD20 und MUM1 exprimieren, wurden in ähnlicher Weise mit 1+ (<1/hpf), 2+ (1–5/hpf) oder 3+ (>5/hpf) bewertet. Die Toluidinblau-Färbung wurde von VitroVivo (ergänzende Abbildung 10) unter Verwendung des VitroView Toluidinblau-Färbekits (VB-3013) durchgeführt. Zwei Hundetumoren wurden aufgrund schlechter Gewebequalität und hoher Hintergrundmarkierung von der immunhistochemischen Analyse ausgeschlossen. Fünf mit Ameisensäure entkalkte menschliche OS-Proben wurden markiert und auf die Expression von CD3, CD20 und CD204 untersucht (Ergänzungstabelle 2).

Für die Kaplan-Meier-Analyse wurde der Log-Rank-Test mit der R-Funktion ggsurvplot survminer Version 0.4.90 berechnet. P-Werte oder Falscherkennungsraten (FDR) von weniger als 0,05 wurden als signifikant angesehen. Alle Statistiken wurden für mehrere Tests mit der Benjamini-Hochberg-Methode (BH) korrigiert, die entweder als Option des verwendeten Softwarepakets bereitgestellt wurde oder mit der p.adjust-Funktion in R verwendet wurde. Details zur Berechnung von GSEA FDR finden Sie in Subramanian et al.102 . Ein zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um die CIBERSORTx-Scores zwischen Clustern zu bewerten. Die Überrepräsentationsanalyse (GO-Analyse) wurde an den Gensätzen mit der PANTHER-Plattform unter Verwendung eines Binomialtests und einer FDR-Korrektur110,111 durchgeführt. Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um eine statistische Analyse der IHC-Färbung mit einem p-Wert von weniger als durchzuführen 0,05 wird als signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Daten zu menschlichen Osteosarkomen aus dem TARGET Childhood Cancer Program sind im NCI Genomic Data Commons Portal öffentlich verfügbar. Die mRNAseq-Daten von Hunden wurden in der Gene Expression Omnibus-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE238110 hinterlegt und sind unter der folgenden URL verfügbar: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE238110.

Der Code ist unter https://doi.org/10.5281/zenodo.8125077 zu finden und wird auch in den Ergänzenden Informationen als Ergänzende Anmerkung 1 bereitgestellt. Es wurden Standardalgorithmen verwendet, wie in den Methoden angegeben. Alle verwendeten Softwarepakete sind Open Source, mit Ausnahme von Ingenuity Pathway Analysis, und stehen der Öffentlichkeit frei zur Verfügung.

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Die RNA-Sequenzierung und die erste Datenanalyse wurden am Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR) an der CCR Sequencing Facility, NCI, NIH, Frederick, MD 21701 durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch das Intramural Program des National Cancer Institute, NIH unterstützt ( Z01-BC006161) und die intramuralen Forschungsprogramme des National Center for Advancing Translational Sciences, NIH (Z01-TR000249). Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Ministeriums für Gesundheit und menschliche Dienste wider, und die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen impliziert auch keine Billigung durch die US-Regierung. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts. Die Autoren danken Joseph Meyer für die Unterstützung bei den grafischen Illustrationen.

Open-Access-Förderung durch die National Institutes of Health (NIH).

Vergleichendes Onkologieprogramm, Zentrum für Krebsforschung, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

Joshua D. Mannheimer, Christina Mazcko, Jessica A. Beck und Amy K. LeBlanc

Abteilung für präklinische Innovation, Abteilung für therapeutische Entwicklung, National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, Rockville, MD, USA

Gregory Four, David Gerhold und John Braisted

Abteilung für pädiatrische Onkologie, Zentrum für Krebsforschung, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

Carly M. Sayers und Troy A. McEachron

Genetikabteilung, Zentrum für Krebsforschung, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

Paul Meltzer

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JDM, GT, DG, JB, AKL, JAB, PM und TAM konzipierten und überwachten die Experimente und Datenanalysen. JDM, CM, JAB, CMS, TAM führten Experimente durch und/oder analysierten die Daten. TAM, DG, PM, JB und GT gaben Einblick in die Darstellung von Daten in Ausstellungsstücken. AKL, JDM und JAB haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse, überarbeiteten den Manuskriptentwurf und lasen und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Amy K. LeBlanc.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Bruce Smith und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Toril Holien und Manuel Breuer. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mannheimer, JD, Tawa, G., Gerhold, D. et al. Transkriptionsprofilierung von Osteosarkomen bei Hunden identifiziert prognostische Genexpressionssignaturen mit translationalem Wert für den Menschen. Commun Biol 6, 856 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05208-z

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Eingegangen: 30. November 2022

Angenommen: 03. August 2023

Veröffentlicht: 17. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05208-z

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